1. Ogow nuugista xalka RNA
Nuugista 280, 320, 230, iyo 260 nm waxay ka dhigan tahay qiyamka aashitada nucleic-ka, asalka (xalinta xalinta), xoojinta milixda, iyo walxaha dabiiciga ah sida borotiinka, siday u kala horreeyaan.Guud ahaan kaliya eeg OD260/OD280 (Qiyaas, R).Marka 1.8 ~ 2.0, waxaan u maleyneynaa in wasakheynta borotiinka ama walxaha kale ee dabiiciga ah ee RNA loo dulqaadan karo, laakiin waa in la ogaadaa in marka Tris loo isticmaalo sida kaydka si loo ogaado nuugista, qiimaha R ayaa laga yaabaa inuu ka weyn yahay 2 (guud ahaan waa inay ahaataa <2.2).Marka R<1.8, wasakhowga borotiinka ama walxaha kale ee dabiiciga ah ee xalka ayaa aad u muuqda, iyo masiirka RNA waxaa lagu go'aamin karaa iyadoo loo eegayo baahiyaha.Marka R> 2.2, waxay ka dhigan tahay in RNA lagu shubay hydrolyzed hal nucleic acid.
2.Habka korantada ee RNA
Guud ahaan, jelka denaturing waxaa loo isticmaalaa RNA electrophoresis, laakiin haddii ay tahay oo kaliya in la ogaado tayada RNA, jel-denature muhiim ma aha, iyo gel agarose caadiga ah waa la isticmaali karaa.Ujeedada electrophoresis waa in la ogaado daacadnimada kooxaha 28S iyo 18S iyo saamigooda, ama daacadnimada smear mRNA.Guud ahaan, haddii xargaha 28S iyo 18S ay dhalaalayaan, cad yihiin, oo fiiqan yihiin (iyadoo la tixraacayo cidhifyada guutooyinku waa cad yihiin), dhalaalka 28S wuxuu ka badan yahay laba jeer kan kooxda 18S, waxaan u aragnaa tayada RNA inay wanaagsan tahay.
Kuwa kore waa labada hab ee aan sida caadiga ah u isticmaalno, laakiin labadan hab midkoodna si cad nooguma sheegi karo haddii uu jiro RNase haraaga ah ee xalka RNA.Haddii ay jirto qadar aad u yar oo RNase ah oo ku jirta xalka, way nagu adagtahay inaan ku ogaanno habka kor ku xusan, laakiin inta badan falcelinta enzymatic ee soo socota ayaa lagu fuliyaa ka sarreeya 37 digrii iyo muddo dheer.Sidan oo kale, haddii ay jirto qadar aad u yar oo RNase ah oo ku jirta xalka RNA, markaa waxaa jiri doona jawi aad u habboon iyo waqti ay ku ciyaaraan doorkooda tijaabooyinka soo socda, dabcan tijaabada ayaa noqon doonta qabow waqtigan.Hoos waxaan ku soo bandhigaynaa hab xaqiijin kara in uu jiro RNase haraaga ah ee xalka RNA.
3. Tijaabada ilaalinta kulaylka
Marka loo eego fiirsashada muunada, ka soo jiid laba 1000 ng RNA oo ka soo baxa xalka RNA oo ku dar 0.5 ml tuubo sentifuge, oo ku dar pH 7.0 Tris baffer wadarta mugga 10 ul, ka dibna xidh daboolka tuubada.Mid ka mid ah ku rid qubeyska heerkulka joogtada ah ee 70 ° C oo ku hay diirimaad 1 saac.Qaybta kale waxaa lagu kaydiyay qaboojiyaha -20°C 1 saac.Marka wakhtigu dhamaado, ka saar labada sambal ee electrophoresis.Ka dib marka electrophoresis la dhammeeyo, is barbar dhig xargaha korantada ee labada.Haddii xargaha labada ay yihiin kuwo joogto ah ama aysan lahayn farqi weyn (dabcan, kooxahoodu waxay sidoo kale buuxiyaan shuruudaha habka 2), waxay la macno tahay inaysan jirin wax wasakh ah oo RNase ah oo ku jira xalka RNA, tayada RNA waa mid aad u wanaagsan.Taa beddelkeeda, haddii muunadda lagu beeray 70°C ay muujiso hoos u dhac muuqda, waxay muujinaysaa in ay jirto wasakhaynta RNase ee xalka RNA.
2 Hababka tijaabada ah iyo farsamooyinka soo saarista RNA
Dhibaatooyinka aan inta badan la kulanno marka la soo saarayo RNA waa: (1) dhalidda RNA waa mid hooseeya;(2) RNA waxay leedahay wasakh milix oo halis ah;(3) RNA waxay leedahay wasakhowga dareeraha ah ee organic;(4) hoos u dhaca tusaalaha iyo dhibaatooyinka kale
1. Wadarta guud ee reagents soo saarista RNA ee sida caadiga ah loo isticmaalo
Habka guanidine isothiocyanate iyo habka Trizol ayaa ah hababka ugu badan ee loo isticmaalo soo saarista wadarta RNA ee unugyada xayawaanka iyo unugyada xayawaanka.Waxay si gaar ah ugu habboon tahay shaybaarro yaryar iyo unugyo ay si gaar ah u adag tahay in la soo saaro, sida soo saarista wadarta RNA ee maqaarka bakaylaha iyo unugyada isku xidha xayawaanka;Intaa waxaa dheer, Trizol, sida reagent lysis guud-ujeedada, sidoo kale waxaa loo isticmaali karaa soo saarista unugyada dhirta, bakteeriyada, fangaska iyo unugyo kale.Unugyada dhirta oo ay ku jiraan polysaccharides iyo polyphenols, sida camellia oleifera, caleenta shaaha, abuur kufsi, iwm, habka CTAB ayaa sidoo kale loo isticmaali karaa in lagu soo saaro wadarta RNA.
Habka caadiga ah, habka laba-geesoodka ah sidoo kale waa mid aad loo jecel yahay sababtoo ah hawlgalkiisa heerkulka caadiga ah, looma baahna in lagu daro RNase, iyo badbaadada - ma jiro chloroform, phenols iyo reagents kale oo organic si loo soo saaro.(alaabta lagu taliyay )
2. Ka soo saarida wadarta RNA ee unugyada xayawaanka
(1) Isku day inaad doorato unug cusub, haddii aysan cusbayn (doorbidayaa saddex bilood gudahood - 80 ℃ qaboojiyaha ama la qaboojiyey nitrogen dareere ah. Markaad gooynayso nudaha, si toos ah ha u gooyn heerkulka qolka, hubi inaad ku riddo sanduuqa barafka, isku day inaad iska ilaaliso baraf soo noqnoqda iyo dhalaalid.
(2) Isticmaal maqas nadiif ah iyo maroojiyeyaal si aad u gooyso cad yar, isku day in aad gooyso qaybta dhexe ee nudaha marka la jarayo muunadda, ama marka hore ka jar qaybta weyn ee dhexda, ka dibna ka jar muunadda meesha la jeexay cusub.Nudaha la soo saaray waa in si buuxda loo jeexjeexo, ku rid nudaha jeexjeexan ee tuubada EP iyada oo aan lahayn RNase, ku dar lysate, nudaha jeexan waa in si buuxda loo soo bandhigaa lysate, oo u diyaargarow isku-dhafka.
(3) Unugyada caadiga ah, dooro unugyo le'eg bean-ga (30-60 mg) si isku mid ah.Haddii unugyadu ay ku jiraan xaddi badan oo borotiin ah, dufan, ama unugyo fibro ah oo cufan ah sida beerka, si habboon u kordhiya ama u yareeyaan tirada unugyada la jaray (ikhtiyaar) Dooro 10 ~ 20 mg).
(4) Haddii la soo saaro muruqa kalluunka, hilibka shrimp, jellyfish iyo unugyo kale oo leh biyo sare, mugga muunada waa in si habboon loo kordhiyo (lagu taliyay 100-200 mg).
(5) Haddii shuruuduhu oggolaadaan, nudaha xayawaanka si toos ah ayaa loo soo saari karaa ka dib marka la isku daro unug-soo-saar sare, haddii aysan jirin qalab noocaas ah.
(6) RNA-ga la helay ka dib soo saarista kama dambaysta ah waa in lagu dhejiyaa sanduuqa barafka isla markiiba si loo yareeyo hoos u dhaca RNA.
3. Soo saarista unugyada xayawaanka ee RNA
(1) Unugyada ka joojinta: si toos ah sentrifuge oo iska tuur dhexdhexaadka, ku maydh PBS nadiif ah 1-2 jeer, ka dibna ku laali qadar ku habboon PBS, ka dibna ku dar lysate si ay u noqoto lysis.Ha ku darin lysate si toos ah unugyada degdegay ka dib markaad si buuxda u tuurto dareeraha.Tani waxay sababi doontaa xirmada histone ee la sii daayo ka dib unugyada lysed ee lakabka sare si ay ugu hoggaansamaan bannaanka unugyada degdega ah, taas oo xaddidaysa xiriirka unugyada gudaha pellet ee leh lysate., taasoo keentay in lysis unug aan dhamaystirnayn iyo hoos u dhac dhalidda RNA.
(2) Unugyada ku dheggan ama aan si adag u adkeyn: Ka dib markaad iska tuurto dhexdhexaadka, ku dhaq PBS 1-2 jeer, ka dibna si toos ah u nuugo qadarka saxda ah ee PBS oo ku afuuf saxanka dhaqanka ee pipette ama qori si aad u afuufiso unugyada, una wareeji unugyada RNA-free.Ku dar lysate tuubada EP ee ensaymka si loo soo saaro.
(3) Unugyada ku dheggan: waxay u baahan yihiin in marka hore lagu shiido trypsin, ka dibna lagu ururiyo tubbada EP-da ee aan RNase, sentrifud si ay u soo saaraan supernatant, lagu maydhay 1-2 jeer PBS si ay u soo saaraan trypsin xad-dhaaf ah, iyo dib u laalay iyadoo qadar ku haboon ee PBS Ka dibna u gudub tallaabada soo saaridda.
4. Soo saarista RNA dhirta
Unugyada dhirta ayaa qani ku ah xeryahooda phenolic, ama hodan ku ah polysaccharides, ama waxaa ku jira qaar ka mid ah dheef-shiid kiimikaad sare oo aan la aqoonsan, ama waxay leeyihiin firfircooni sare oo RNase ah.Walxahaan waxaa si adag loogu daraa RNA ka dib lysis unug si ay u sameeyaan isku dhisyo aan la milmi karin ama kolloidals, kuwaas oo ay adagtahay in la saaro.Sidaa darteed, marka aan soo saarno unugyada dhirta, waxaan u baahanahay inaan doorano xirmo dhirta.Lisate ee xirmada waxay si wax ku ool ah u xallin kartaa dhibaatooyinka oksaydhka fudud ee polyphenols iyo kala-soocidda xeryahooda polysaccharide iyo asiidhyada nucleic.
(Wixii loogu talagalay soo saarista dhirta polyphenol polyphenol RNA, alaabta lagu taliyay:
(1) Diirka, saxarka, iniinaha, caleemaha, iwm. ee geedka waa in si buuxda loo geliyo hoobiye.Inta lagu jiro habka shiididda, nitrogen dareeraha ah waa in lagu buuxiyaa wakhtiga si looga fogaado dhalaalidda saamiga.Muunada dhulka waa in si degdeg ah loogu daraa lysate oo la ruxruxo si looga fogaado xaalufka RNA.
(2) Shaybaarada hodanka ku ah fiber-ka sida bariiska iyo caleenta qamadiga, qadarka soo saarista waa in si habboon loo dhimaa, haddii kale shiididda nudaha iyo lysis ma dhammayn doonaan, taasoo keenta dhallin hooseeya ee RNA la soo saaray.
(3) Unugyada dhirta leh biyaha sare, sida miraha rummaanka, miraha qaraha, miraha miraha, iwm, cabbirka saamiga waa in si habboon loo kordhiyo (100-200 mg waa ikhtiyaari).
(4) Unugyada dhirta, sida caleemaha dhirta, rhizomes, miraha adag iyo walxaha kale ayaa guud ahaan lagula talinayaa in la isticmaalo nitrogen dareere ah si ay si fiican u daadiyaan maaddooyinka ku jira hoobiye, ka dibna u sii gudub tallaabada soo saarista.Homogenizer-yada unugyada caadiga ah waxaa laga yaabaa inaysan wax ku ool u noqonin isku-dhafka unugyada dhirta, guud ahaanna laguma talinayo.
5. Taxadarrada soo saarista RNA
(1) Tijaabooyin unugyadu waa inay noqdaan kuwo cusub intii suurtogal ah si looga fogaado baraf soo noqnoqda iyo dhalaalidda.
(2) Nudaha waa in si buuxda loo dhulka u dhigaa marka la soo saarayo, waana in cadadka nudaha aanu noqon mid aad u yar, iska daa in la badsado.
(3) Waqti ku filan waa in la bixiyaa ka dib marka lagu daro lysate si ay si buuxda u lyse muunada.
(4) Markaad isticmaalayso habka Trizol ee soo saarista, mabda'a nuugista supernatant ka dib stratification waa "doorbidayaa in la nuugo in ka yar in la neefsado", waana in aan la soo saarin lakabka dhexe, haddii kale waxay keeni doontaa wasakheynta DNA-da genomic ee halista ah.
(5) Marka la dhaqayo, dareeraha wax lagu dhaqo waa inuu si buuxda u soo dhex galaa hareeraha gidaarka tuubada si loo hubiyo dhaqid fiican.
(6) Habka soo saarista tiirka, marka lagu daro kala-goynta tiirka ka dib marka la dhaqo, tiirka xayeysiinta waa in sidoo kale lagu dhejiyaa kursi nadiif ah oo nadiif ah oo la afuufo 5-10 daqiiqo si uu si buuxda u uumi-baxo dareeraha organic si qallayl.
(7) Marka ugu dambaysa ee habka tiirka, ka dib marka lagu daro biyaha DEPC, waa in lagu dhajiyaa 3-5 daqiiqo, ama biyaha DEPC waa in lagu kululeeyaa 60 ° C ka hor si loo kordhiyo wax-soo-saarka elution.Habka dhaqameed ee Trizol jeexjeexa iyo habka roobka isopropanol, RNA kama dambaysta ah ayaa lagu kala diraa biyaha DEPC, markaa wakhti ku habboon waa in la siiyaa kala diris, iyo hoose ee tuubada centrifuge waa in si joogto ah loogu afuufo caarada pipette.
3 Three Sababaha iyo xalalka fiirsashada RNA hoose/tayada liidata
1. Wax-soo-saarku aad buu u hooseeyaa
Muunadda la soo saaray aad bay u yar tahay, wadarta qaddarku kuma filna, ama muunadda la soo saaray aad bay u badan tahay oo lysisku ma dhammaystirna;unugyada ama unugyada tayada ku habboon waa in loo adeegsadaa soo saarista, daawaynta hore ee shaybaarka waa in si fiican loo sameeyaa, lysiskuna waa inuu ku filan yahay.
2. Hadhaaga genome
Marka la soo saaro habka Trizol, marka dufanka la nuugo lakabka dhexe ka dib, wasakhowga genome-ga ayaa sababi doona;taxadar dheeraad ah waa in la qaataa marka lakabka la saarayo si looga fogaado nuugista lakabka dhexe.Haddii habka tiirka loo isticmaalo soo saarista, xirmo ka kooban DNA-ga ayaa loo dooran karaa soo saarista.Aashitada nucleic-ka ah ee lagu dhajiyay xuubka ayaa si toos ah loogu shiidayaa DNA-da I, taas oo aad u yareyn karta hadhaaga DNA.
3. Hoos u dhaca RNA
Waxay noqon kartaa hoos u dhaca muunadda la soo saaray lafteeda, ama hoos u dhac ku yimid habka soo saarista;Inta suurtogalka ah, muunado cusub waa in loo isticmaalo soo saarista RNA, muunadaha la ururiyeyna waa in lagu kaydiyaa qaboojiyaha dareeraha ah ee nitrogen ama -80°C waqtiga, iyo barafaynta iyo dhalaalidda soo noqnoqda waa in laga fogaadaa.Tilmaamaha bilaashka ah ee RNase/DNase, tuubooyinka centrifuge iyo agabyada kale waa in loo adeegsadaa habka soo saarista RNA.Habka soo saarista waa inuu ahaadaa sida ugu dhakhsaha badan ee suurtogalka ah.RNA-ga la soo saaray waa in lagu dhejiyaa sanduuqa barafka oo lagu kaydiyaa -80 wakhtiga.Haddii RNA-ga la soo saaray uu u baahan yahay in lagu ogaado jel electrophoresis, electrophoresis waa in la sameeyaa isla markiiba ka dib marka la soo saaro, iyo qalabka elektrophoresis waa in lagu beddelaa mid cusub oo la diyaariyey.
4. Cusbada iyo haraaga dareeraha organic
Reageniyeyaasha soo saarista waxaa ku jira phenol iyo guanidine cusbada, iyo xalka lagu dhaqo waxaa ku jira ethanol.Inta lagu jiro habka soo saarista, lysate si buuxda looma nuugin oo la tuuray, iyo xalalka dhaqidda si buuxda looma qallajin.Cusbada hadhaaga ah iyo dareerayaasha organic-ga ah waxay waxyeelo u geystaan qoraal-celinta dambe iyo PCR.Heerarka kala duwan ee xannibaadda, sidaas darteed lysate nudaha waa in si buuxda loo saaraa inta lagu jiro habka soo saarista, iyo dhaqiddu waa inay ahaato mid ku filan si darbiyada ku wareegsan ee tuubada loo dhaqo.Intaa waxaa dheer, tuubada waa la faaruqiyay oo la afuufay waa tallaabo lagama maarmaan ah, taas oo sii yareyn doonta hadhaaga walxaha organic.
Wixii macluumaad dheeraad ah oo ku saabsan soo saarista RNA, fadlan raac shabakadayada:
www.foreivd.com wixii macluumaad dheeraad ah.
Waqtiga boostada: Dec-01-2022
