• PCR waa hab loo isticmaalo in lagu kordhiyo DNA-ga qadar yar oo DNA ah.RT-PCR waxay adeegsataa qoraal-ku-soo-noqod si ay u soo saarto qaab DNA ah oo laga helo isha RNA oo markaa la kordhin karo.
• PCR iyo RT-PCR caadi ahaan waa falcelin-dhamaadka, halka qPCR iyo RT-qPCR ay isticmaalaan kinetics-ka heerka isku-darka badeecada inta lagu jiro falcelinta PCR si loo qiyaaso tirada template ee jirta.
• Hababka cusub, sida PCR dhijitaalka ah, waxay bixiyaan qiyaas buuxa oo ah qaabka DNA-ga bilowga ah, halka hababka ay ka midka yihiin PCR isothermal ay yareeyaan baahida qalab qaali ah si ay u bixiyaan natiijooyin la isku halayn karo.

Fal-celinta silsiladda polymerase (PCR) waa farsamo bayooloji unugyo ah oo si fudud loo isticmaalo si loo kordhiyo loona ogaado taxanaha DNA iyo RNA.Marka la barbardhigo hababka dhaqameed ee cloning DNA iyo xoojinta, kuwaas oo inta badan qaadan kara maalmo, PCR waxay u baahan tahay dhowr saacadood oo keliya.PCR aad ayuu xasaasi u yahay wuxuuna u baahan yahay template ugu yar si loo ogaado loona kordhiyo taxane gaar ah.Hababka aasaasiga ah ee PCR ayaa ka sii horumaray DNA-ga fudud iyo ogaanshaha RNA.Hoosta, waxaan ku siinnay dulmar hababka kala duwan ee PCR iyo reagents-yada aan ku bixinno Enzo Life Sciences baahidaada cilmi-baarista.Waxaan higsaneynaa inaan ka caawino saynisyahanada inay si dhakhso leh u helaan PCR reagents si ay ugu adeegsadaan mashruucooda cilmi baarista soo socda!

PCR

PCR-ga caadiga ah, waxa kaliya ee aad u baahan tahay waa polymerase DNA, magnesium, nucleotides, primers, qaabka DNA ee la xoojiyey, iyo heerkulbeeye.Habka PCR waa mid fudud sida ujeeddadiisa: 1) DNA-da laba-jibbaaran (dsDNA) waa kuleyl la diiday, 2) aasaasiyaal ku toosan xargaha DNA-da kaliya, iyo 3) furayaasha waxaa lagu kordhiyey DNA polymerase, taasoo keentay in laba nuqul oo ka mid ah DNA asalka ah.Denaturation, annealing, iyo geeddi-socodka dheeraynta ee taxane ah ee heerkulbeegyada iyo waqtiyada waxaa loo yaqaannaa hal wareeg oo cod-weyneyn ah (Jaantus. 1).

Tallaabo kasta oo wareegga ah waa in loo hagaajiyaa qaab-dhismeedka iyo habka aasaasiga ah ee loo isticmaalo.Wareeggani waxa lagu soo noqnoqda qiyaastii 20-40 jeer, ka dibna badeecada la xoojiyey ayaa la falanqeyn karaa, sida caadiga ah jel agarose (Jaantus. 2).

Maaddaama PCR uu yahay hab xasaasi ah oo aad u yar ayaa looga baahan yahay hal falcelin, diyaarinta isku darka sayid ee dhowr falcelin ayaa lagula talinayaa.Isku darka sayidku waa inuu noqdaa mid si fiican isku dhafan ka dibna loo qaybiyo tirada falcelinta, hubinta in falcelin kasta ay ku jiri doonto qadar isku mid ah enzyme, dNTPs, iyo primers.Alaab-qeybiyeyaal badan, sida Enzo Life Sciences, ayaa sidoo kale bixiya PCR isku-dar ah oo horeyba uga koobnaa wax kasta marka laga reebo aasaasayaasha iyo qaabka DNA-da.

Gobollada Guanine/Cytosine-hodan (GC-hodan) waxay u taagan yihiin caqabad xagga farsamooyinka PCR-ga caadiga ah.Taxanaha hodanka ku ah GC ayaa ka xasilan marka loo eego taxanaha ka kooban GC hoose.Intaa waxaa dheer, taxanaha GC-hodanka ah waxay u muuqdaan inay sameeyaan dhismayaal sare, sida timaha biinanka.Natiijo ahaan, xargaha labanlaaban ee qani ku ah GC way adagtahay in si buuxda loo kala saaro inta lagu jiro marxaladda denaturation.Sidaa darteed, polymerase DNA ma samayn karo xadhig cusub iyada oo aan la joojin.Heerkulka denaturation oo sarreeya ayaa tan wanaajin kara, iyo hagaajinta heerkul-ku-jiidasho sare iyo wakhtiga soo-jiidashada oo gaaban waxay ka hortagi kartaa isku-xidhka aan khaaska ahayn ee aasaasayaasha hodanka ku ah GC.Reagents dheeraad ah ayaa wanaajin kara kordhinta isku xigxiga qani ku ah GC.DMSO, glycerol, iyo betaine waxay caawiyaan inay carqaladeeyaan qaababka labaad ee ay sababto isdhexgalka GC oo ay markaas fududeeyaan kala soocida xargaha labanlaaban.

Hot Start PCR

Kordhinta aan la cayimin waa dhibaato dhici karta inta lagu jiro PCR.Inta badan DNA-da polymerases ee loo isticmaalo PCR waxay si fiican ugu shaqeeyaan heerkul ku dhow 68°C ilaa 72°C.Insaymiska ayaa si kastaba ha ahaatee, sidoo kale ku firfircoonaan kara heerkulka hoose, inkastoo uu heer hoose yahay.Heerkulka ka hooseeya heerkulka jilbiska, alwaaxdu waxay ku xidhmi karaan si aan gaar ahayn waxayna u horseedi karaan cod-weyneyn aan gaar ahayn, xitaa haddii falcelinta lagu rakibo baraf.Tan waxaa looga hortegi karaa iyadoo la isticmaalo polymerase inhibitors oo ka sooca DNA-ga polymerase kaliya marka heerkul gaar ah la gaaro, sidaas awgeed ereyga PCR ee bilawga kulul.Inhibitor-ku wuxuu noqon karaa antibody-ku xidha polymerase iyo denatures heerkulka denaturation ee bilowga ah (95°C caadi ahaan).

Fidelity Sare Polymerase

Iyadoo polymerases DNA-ga ay si sax ah u xoojiyeen qaabka asalka ah ee isku xigxiga, khaladaadka ku habboon ee nucleotide ayaa dhici kara.Isku-dheelitir la'aanta codsiyada sida cloning waxay keeni kartaa qoraallo la gooyay, iyo borotiinada aan si khaldan loo turjumay ama aan shaqaynayn.Si looga fogaado is-maandhaafkan, polymerases leh waxqabad "wax-akhris" ayaa la aqoonsaday oo lagu daray socodka shaqada.Polymerase-kii ugu horreeyay ee wax-akhris, Pfu, ayaa lagu aqoonsaday 1991-kii Pyrococcus furiosus.Enzyme Pfu-gani waxa uu leeyahay 3'ilaa 5' hawlqabad exonuclease.Marka DNA-da la kordhiyo, exonuclease-ku waxa uu ka saarayaa nucleotide-yada aan is-qanidin ee 3' dhamaadka xadhigga.Nucleotide sax ah ayaa markaa la bedelayaa, DNA-da ayaa sii socota.Aqoonsiga taxanaha nucleotide ee khaldan waxay ku salaysan tahay isku xidhka xidhitaanka saxda ah ee nucleoside triphosphate oo leh enzyme, halkaas oo isku-xidhka aan fiicnayn ay hoos u dhigto isku-dhafka waxayna u ogolaataa beddelka saxda ah.Dhaqdhaqaaqa wax-akhrinta ee Pfu polymerase waxay keentaa khaladaad yar oo isku xigxiga u dambeeya marka la barbar dhigo Taq DNA polymerase.Sanadihii la soo dhaafay, enzymes kale oo wax-akhris ah ayaa la aqoonsaday, iyo wax ka beddelka enzymkii asalka ahaa ee Pfu ayaa la sameeyay si loo sii yareeyo heerka qaladka inta lagu jiro xoojinta DNA.

RT-PCR

Dib-u-celinta PCR, ama RT-PCR, waxay ogolaataa isticmaalka RNA qaab ahaan.Tallaabo dheeraad ah ayaa u oggolaanaysa ogaanshaha iyo xoojinta RNA.RNA waxa loo rogaa DNA-ga dhammaystiran (cDNA), iyada oo la adeegsanayo qoraal-ku-soo-noqod.Tayada iyo nadiifnimada qaabka RNA ayaa lama huraan u ah guusha RT-PCR.Talaabada koowaad ee RT-PCR waa isku-dhafka DNA/RNA.Qoraalka dib u celinta ayaa sidoo kale leh shaqada RNase H, kaas oo hoos u dhigaya qaybta RNA ee isku-dhafka.Unugyada DNA-da ee hal-geeska ah ayaa markaa lagu dhammeeyaa DNA-ku-tiirsanaanta DNA-da polymerase ee qoraalka gadaasha cDNA.Wax ku oolnimada falcelinta xadhiga-koowaad waxay saamayn kartaa habka kor u qaadida.Laga bilaabo halkan, nidaamka caadiga ah ee PCR waxaa loo isticmaalaa in lagu kordhiyo cDNA.Suurtagalnimada in RNA loogu celiyo cDNA ee RT-PCR waxay leedahay faa'iidooyin badan, waxaana ugu horreyn loo isticmaalaa falanqaynta muujinta hidda-socodka.RNA waa hal-xidhaale oo aad u deggan, taas oo ka dhigaysa mid adag in lala shaqeeyo.Waxay caadi ahaan u adeegtaa sida tallaabada ugu horreysa ee qPCR, taasoo qiyaaseysa qoraallada RNA ee muunad bayooloji ah.

qPCR iyo RT-qPCR

Tirada PCR (qPCR) waxaa loo isticmaalaa in lagu ogaado, lagu garto oo lagu qiyaaso asiidhyada nuclei ka codsiyo badan.Gudaha RT-qPCR, qoraalada RNA waxaa inta badan lagu qiyaasaa iyadoo dib loogu celinayo cDNA marka hore, sida kor lagu sharaxay, ka dibna qPCR ayaa la sameeyaa.Sida PCR-ga caadiga ah, DNA-da waxaa lagu xoojiyay saddex tillaabo oo soo noqnoqda: denaturation, annealing, iyo elongation.Si kastaba ha ahaatee, qPCR, calaamadaynta fluorescent waxay awood u siinaysaa ururinta xogta marka PCR uu sii socdo.Farsamadani waxay leedahay faa'iidooyin badan sababtoo ah noocyada kala duwan ee hababka iyo kimistariga la heli karo.

qPCR dheeha ku salaysan (sida caadiga ah cagaar), calaamadaynta fluorescent waxay ogolaataa qiyaasida molecules DNA-da la xoojiyay iyadoo la adeegsanayo isticmaalka dheeha xidha dsDNA.Inta lagu jiro wareeg kasta, fluorescence waa la cabbiraa.Calaamadaha fluorescence-ku wuxuu u kordhaa saami ahaan tirada DNA-da la soo koobay.Sidaa darteed, DNA-da waxaa lagu qiyaasaa "waqtiga dhabta ah" (Jaantus. 3).Khasaaraha uu leeyahay qPCR-ku salaysan dheeha ayaa ah in hal bartilmaameed oo keliya la baari karo markiiba iyo in dheehu ku xidho ds-DNA kasta oo ku jira muunadda.

QPCR-ku-salaysan baadhitaan, bartilmaameedyo badan ayaa lagu ogaan karaa isku mar muunad kasta, laakiin tani waxay u baahan tahay tayaynta iyo naqshadaynta baadhitaan(yada) gaarka ah ee loo adeegsado marka lagu daro aasaasayaasha.Noocyo dhowr ah oo nashqadaha baaritaanka ayaa la heli karaa, laakiin nooca ugu caansan waa baaritaanka hydrolysis, kaas oo ku jira fluorophore iyo quencher.Wareejinta tamarta resonance resonance (FRET) waxay ka hortagtaa qiiqa fluorophore-ka iyadoo la sii marinayo quencher inta baaritaanka uu yahay mid sugan.Si kastaba ha ahaatee, inta lagu jiro falcelinta PCR-ga, baaritaanka waa la nadiifiyaa inta lagu jiro fidinta asaasiga ah iyo xoojinta habka gaarka ah ee ay ku xiran tahay.Kala-baxa baaritaanka wuxuu kala soocaa fluorophore-ka iyo quencher-ka wuxuuna keenaa kororka ku-tiirsanaanta kor u kaca ee fluorescence (Jaantus. 4).Haddaba, calaamada fluorescence-ka ee falcelinta qPCR-ku-salaysan waxay u dhigantaa qaddarka isku xigxiga bartilmaameedka baaritaanka ee ku jira muunadda.Sababtoo ah qPCR-ku-salaysan baadhida ayaa ka gaar ah qPCR-ku-salaysan dheeha, badiyaa waa tignoolajiyada loo isticmaalo qiimaynta ogaanshaha ku salaysan qPCR.

Kordhinta Isothermal

Farsamooyinka PCR ee aan kor ku soo sheegnay waxay u baahan yihiin qalab heerkulbeegyo qaali ah si ay si sax ah kor ugu qaadaan oo hoos ugu dhigaan heerkulka qolka ee tillaabooyinka diidmada, baabiinta, iyo fidinta.Tiro farsamo ayaa la sameeyay oo aan u baahnayn aaladaha saxda ah ee noocaas ah waxaana lagu samayn karaa qubeyska biyaha fudud ama xitaa gudaha unugyada xiisaha.Farsamooyinkan waxaa si wadajir ah loogu yeeraa xoojinta isothermal iyo shaqada ku salaysan jibbaarada, toosan, ama xoojinta cascade.

Nooca ugu caansan ee cod-weyneysiinta isothermal waa loop-mediated isothermal amplification, ama LAMP.LAMP waxay isticmaashaa kordhinta jibbaarada 65⁰C si ay u xoojiso template DNA ama RNA.Marka la samaynayo LAMP, afar ilaa lix aasaasi oo kaabaya gobollada DNA-da la beegsanayo ayaa la isticmaalaa polymerase DNA si loo soo saaro DNA cusub.Laba ka mid ah aasaasayaashan waxay leeyihiin taxane is-xigxiga oo aqoonsanaya taxanaha aasaasiga ah oo isku xidha, taas oo u oggolaanaysa in qaab-dhismeedka “loop” uu ku sameeyo DNA-da cusub ee la farsameeyey oo ka dibna caawisa soo-jiidashada asaasiga ah ee wareegyada soo socda ee xoojinta.LAMP waxaa lagu arki karaa habab badan, oo ay ku jiraan fluorescence, agarose gel electrophoresis, ama colorimetry.Fududeynta muuqaalka iyo ogaanshaha joogitaanka ama maqnaanshaha badeecada iyadoo loo eegayo midabka midabka iyo la'aanta qalab qaali ah ayaa ka dhigtay LAMP ikhtiyaar ku habboon baaritaanka SARS-CoV-2 ee meelaha aan baarista shaybaarka caafimaad si diyaar ah loo helin, ama kaydinta iyo qaadista muunado. ma ahayn mid macquul ah, ama shaybaadhka aan hore u haysan qalabka kulaylka PCR.