Qiimaha Ct waa qaabka ugu muhiimsan ee natiijada PCR ee tirooyinka fluorescent.Waxa loo isticmaalaa in lagu xisaabiyo kala duwanaanshaha muujinta hidde-sidaha ama lambarka koobiga hiddaha.Haddaba waa maxay qiimaha Ct ee tirooyinka fluorescence ee loo arko mid macquul ah?Sidee loo hubin karaa tirada waxtarka leh ee qiimaha Ct?
Waa maxay Ct Value?
Inta lagu jiro habka qPCR-ka weynaynta, tirada u dhiganta ee wareegyada cod-weyneysiinta (Cycle Threshold) marka calaamada fluorescence ee sheyga la xoojiyay uu gaaro heerka sare ee fluorescence.C waxay u taagan tahay Cycle iyo T waxay u taagan tahay Xadka.Si fudud loo dhigo, qiimaha Ct waa tirada wareegyada u dhigma marka kor u qaadida qaabeynta bilowga ah ay gaarto qaddar go'an oo badeecad ah qPCR.Waxa loogu yeero "qadar cayiman oo badeecad ah" ayaa dib loo sii sharxi doonaa.
Muxuu sameeyaa qiimaha Ct?
1.Xiriirka ka dhexeeya kordhinta jibbaarada, qaddarka template iyo qiimaha Ct
Fikrad ahaan, hiddo-wadaha ku jira qPCR waxa lagu ururiyaa kordhinta jibbaarada ka dib tiro cayiman oo wareegyo ah.Xidhiidhka ka dhexeeya tirada wareegyada cod-weyneysiinta iyo cadadka alaabadu waa: Qadarka badeecada la xoojiyey = tirada template bilowga × (1+En) lambarka wareegyada.Si kastaba ha ahaatee, falcelinta qPCR had iyo jeer kuma jirto xaalad ku habboon.Marka xadiga badeecada la xoojiyey ay gaadho "qadarka alaabta qaarkood", tirada wareegyada wakhtigan waa qiimaha Ct, waxayna ku jirtaa xilliga jibbaarada.Xidhiidhka ka dhexeeya qiimaha Ct iyo qadarka template bilowga: Waxa jira xidhiidh toosan oo u dhexeeya qiimaha Ct ee templateka iyo logarithmka lambarka koobiga bilawga ah ee template.Marka ay sare u kacdo fiirsiga template-ka bilowga ah, waa yaraanta qiimaha Ct;hoos u fiirsashada template bilowga ah, waa weyn yahay qiimaha Ct.
2.Amplification curve, heerka fluorescence iyo qadar alaabta PCR gaar ah
Qadarka alaabta qPCR ee kor u qaadida waxaa si toos ah loogu soo bandhigay qaabka calaamada fluorescent, taas oo ah, qalooca codka.Marxaladda hore ee PCR, kordhintu waxay ku hoos jirtaa xaalado ku habboon, tirada wareegyada waa yar tahay, ururinta alaabadu waa yar tahay, heerka fluorescence si cad uma kala saari karo asalka fluorescence.Taas ka dib, fluorescence-ku wuu kordhaa oo wuxuu galaa marxaladda jibbaarada.Qadarka badeecada PCR waxaa lagu ogaan karaa waqti go'an marka falcelinta PCR ay tahay kaliya marxaladda jibbaarada, taas oo loo isticmaali karo "caddad cayiman oo badeecad ah", iyo nuxurka bilowga ah ee template-ka ayaa laga soo saari karaa tan.Sidaa darteed, xoogga calaamada fluorescence ee u dhiganta qaddar gaar ah oo badeecada ah waa marinka fluorescence.
Marxaladda dambe ee PCR, qalooca cod-weyneyntu mar dambe ma muujinayso weynaynta jibbaarada, oo waxay gashaa wejiga toosan iyo wejiga dhulka.
3.Dib u soo saarida qiyamka Ct
Marka wareegga PCR uu gaaro lambarka wareegga ee qiimaha Ct, waxa ay hadda gashay xilliga jibbaarada runta ah.Waqtigan xaadirka ah, qaladka yar lama kordhin, markaa dib u soo saarida qiimaha Ct waa mid aad u fiican, taas oo ah, isla template ayaa la xoojiyay waqtiyo kala duwan ama tuubooyin kala duwan isku mar.Kordhinta, qiimaha Ct ee la helay waa mid joogto ah.
1.Amplification hufnaanta En
Hufnaanta PCR-ga waxaa loola jeedaa waxtarka uu polymerase-ku u beddelayo hidda-wadaha in lagu kordhiyo amplicon.Waxtarka kor u qaadista marka hal unug DNA loo beddelo laba unug oo DNA ah waa 100%.Hufnaanta kordhinta waxa caadi ahaan loo muujiyaa sida En.Si loo fududeeyo falanqaynta maqaallada soo socda, arrimaha saameeya waxtarka kordhinta ayaa si kooban loo soo bandhigayaa.
| Arrimaha saameeya | sharaxaad | Sidee loo xukumaa? |
| A. PCR horjoogayaasha | 1. Qaabka DNA-da waxaa ku jira walxo joojiya falcelinta PCR, sida borotiinada ama saabuunta.2. cDNA ka dib qoraal-ku-soo-noqoshada ka dib waxay ka kooban tahay fiirsashada sare ee template RNA ama qaybaha reagent RT, kaas oo sidoo kale joojin kara falcelinta PCR ee xiga. | 1. Haddii ay jirto wasakh ayaa lagu qiimayn karaa iyadoo la cabbirayo saamiga A260/A280 iyo A260/A230 ama RNA electrophoresis.2. Haddii cDNA lagu qasi jiray si waafaqsan saamiga go'an ka dib qoritaanka gadaasha. |
| B. Naqshadaynta asaasiga ah ee aan habboonayn | Qorayaasha si fiican uma tirtiraan | Ka hubi furayaasha furayaasha-dimers-ka ama biinanka timaha, is-maan-dhaafka, iyo mararka qaarkood nashqado gudaha ah. |
| C. Naqshadeynta barnaamijka falcelinta PCR-ga aan habboonayn | 1. Furayaasha si wax ku ool ah uma tirtiri karaan2. Sii dayn ku filan DNA polymerase 3. Dhaqdhaqaaqa DNA polymerase heerkulka sare ee muddada-dheer ayaa hoos u dhacay | 1. Heerkulka annealing ayaa ka sarreeya qiimaha TM ee asaasiga ah2. Wakhtiga dhalmada ka hor aad buu u gaaban yahay 3. Waqtiga marxalad kasta ee habraaca falcelinta aad buu u dheer yahay |
| D. Qaladaadka reagents ama tuubooyinka oo aan ku filnayn | Nidaamka falcelinta, diiradda maxalliga ah ee qaybaha falcelinta PCR aad bay u sarraysaa ama aan sinnayn, taasoo keentay in aan jibbaaran weynayn ee PCR. | |
| E. Dhererka Amplicon | Dhererka amplicon waa mid aad u dheer, ka badan 300bp, iyo waxtarka kordhintu waa hooseeyaa | Hubi in dhererka amplicon uu u dhaxeeyo 80-300bp |
| F. Saamaynta reageyaasha qPCR | Feejignaanta DNA-da polymerase ee reagent waa mid hooseeya ama fiirsashada ions ee kaydiyaha aan la hagaajin, taasoo keentay in dhaqdhaqaaqa Taq enzyme uusan gaarin heerka ugu sarreeya. | Go'aaminta waxtarka weyneynta ee qalooca caadiga ah |
2.Range of Ct qiyamka
Qiimaha Ct wuxuu u dhexeeyaa 15-35.Haddii qiimaha Ct uu ka yar yahay 15, waxaa loo tixgelinayaa in cod-weyneyntu ay ku dhex jirto inta u dhexeysa xilliga aasaasiga ah iyo heerka fluorescence aan la gaarin.Fikrad ahaan, waxaa jira xiriir toosan oo u dhexeeya qiimaha Ct iyo logarithm ee lambarka koobiga bilowga ah ee template, taas oo ah, qalooca caadiga ah.Iyada oo loo marayo qalooca caadiga ah, marka waxtarka kor u qaadida uu yahay 100%, qiimaha Ct ee la xisaabiyay ee lagu qiyaaso lambarka koobi ee hiddasidaha ayaa ku dhow 35. Haddii ay ka weyn tahay 35, nambarka koobiga bilowga ah ee template ayaa aragti ahaan ka yar 1, taas oo loo tixgelin karo mid aan macno lahayn.
Noocyada hiddo-wadaha Ct ee kala duwan, iyadoo ay ugu wacan tahay kala duwanaanshaha lambarka nuqulka hidda-wadaha iyo waxtarka kordhinta qaddarka template ee bilowga ah, waxaa lagama maarmaan ah in la sameeyo qalooca caadiga ah ee hiddasidaha oo la xisaabiyo cabbirka ogaanshaha tooska ah ee hiddaha.
3.Waxyaabaha saamaynta ku leh qiimaha Ct
Laga soo bilaabo xiriirka ka dhexeeya tirada wareegyada cod-weyneysiinta iyo qadarka alaabta: qadarka alaabta la xoojiyay = qadarka template bilowga × (1+E) lambarka wareegga, waxaa la arki karaa in xaaladaha ku habboon, qadarka template bilowga ah iyo En waxay yeelan doontaa saameyn taban oo ku saabsan qiimaha Ct.Farqiga u dhexeeya tayada template ama hufnaanta kordhintu waxay keeni doontaa in qiimaha Ct uu aad u weyn yahay ama aad u yar yahay.
4.Ct qiimaha waa mid aad u weyn ama aad u yar
Waqtiga boostada: Febraayo-22-2023
