Qof kastaa wuxuu ka hadlayaa mabda'a tijaabada qRT-PCR, naqshadaynta asaasiga ah, fasiraadda natiijada, iwm., laakiin waxaan filayaa inaan kula wadaago hawlgalka tijaabada ah ee qRT-PCR.Way yar tahay, laakiin waxay ku saabsan tahay natiijada.

Kahor intaanan samayn qRT-PCR, waxaan u baahanahay inaan si cad u fahanno RNA noo gaar ah iyo hababka hawlgalka.Ka dib oo dhan, dadaalkeena waxaa loogu talagalay inaan natiijooyin helno, halkii aan si fudud u shaqeyn lahayn.Markaa ka hor intaanan samayn qRT-PCR, waxaan u baahanahay inaan go'aamino arimaha soo socda (qaar ka mid ah kuwaa oo kaliya ayaa lagu dabaqi karaa SYBR).

1 Ma hubtaa in RNA-gaagu aanu hoos u dhicin?

NanoDrop 2000 waxa kaliya oo lagu ogaan karaa fiirsiga iyo nadiifnimada RNA, laakiin ma ogaan karo daacadnimada RNA.

Qiimaha RNA (RNA Intesity Number) wuxuu ka turjumi karaa daacadnimada RNA, kaas oo lagu ogaado nidaamka Agilent 2100 Bioanalyzer.

Jaantuska jaantuska qiyamka RIN ee muunadaha RNA ee kala duwan (eukaryotes)

Si kastaba ha ahaatee, shaybaadhka guud ahaan ma laha Agilent 2100 Bioanalyzer.Xaaladdan oo kale, waxaan ku ogaan karnaa iyada oo loo marayo jel formaldehyde, laakiin shuruudaha wadarta guud ee RNA waa sarreeyaa, markaa habka ugu dhaqsaha badan waa in la isticmaalo gel electrophoresis caadiga ah.Waxaa loo baahan yahay in ay ku jirto jawi ka xor ah nuclease, sidaas darteed waxaa lagama maarmaan ah in la dhaqo taangiga electrophoresis, dhalada sol, jilbaha jel iyo shanlada biyaha DEPC.Agaroseku sidoo kale waa xor nukliyeerka (ilaa inta uu cusub yahay), iyo Loading Buffer waa in si cusub loo furo intii suurtogal ah, oo leh 1.2% jel.

Ogsoonow in jelku uu si buuxda u milmay, haddii kale waxa ay keenaysaa xadhkaha is-qabsiga, sida ku cad muunadda 9 ee shaxanka.Haddii danabku uu aad u sarreeyo ama uu socdo muddo aad u dheer wuxuu dhalin doonaa kulayl wuxuuna sababi karaa hoos u dhaca RNA, markaa tamarta iyo waqtiga waa in si macquul ah loo xakameeyaa.Intaa waxa dheer, orodka jel waxa kale oo uu sii go'aamin karaa in hadhaa DNA ku jiro muunadda, oo fiirso in ay jiraan tiro badan oo xadhig la hayo oo ceelka qaybinaya.

SawirkaGel electrophoresis ogaanshaha RNA

2 Ma hubtaa fiirsashada cDNA-gaaga?

Waayo-aragnimada walaalaha waaweyn ee shaybaadhka ayaa ah in cDNA-da nidaamka 20 ul ee ay helaan rogaal-celin kasta si toos ah loo milo 20X, halka walaalaha ka dambeeya dhakhaatiirta lagu qasi karo 10X.Inta badan waxaan ku tiirsanahay xaalada.Sababtoo ah tayada RNA ee uu sheegay qof kastaa way ka duwan tahay, heerka dib u noqoshada ayaa sidoo kale ka duwan, tiknoolajiyada dib u noqoshada ayaa laga yaabaa inaanay xasilloonayn.

Marka mar kasta oo aan helo cDNA-ga rogan, waxaan marka hore ku milmi doonaa ilaa 3 jeer, ka dibna waxaan isticmaali doonaa hidda-wadaha guriga si aan u sameeyo RT-PCR, tirada wareegyada guud ahaan waa 25 wareegyo, si aan u aqoonsado diiradda gaarka ah, ka dibna waxaan go'aamin doonaa qodobka ugu dambeeya ee milanka.

3 Ma hubtaa in furayaashaagu ay fududahay in la isticmaalo?

Waxay ka gudbi kartaa qalooca dhalaalka ee qRT-PCR, laakiin tani wali waxay ku kacaysaa lacag.Shaybaadhyada aan lacag badan lahayn, marka ay helaan qalabyo badan, waxay isticmaali karaan RT-PCR caadiga ah si ay u ogaadaan haddii ay tahay hal koox oo ay aqoonsadaan qaaska ah ee asaasiga ah.Haddii shaybaarku aanu lacag ka yarayn, gaar ahaan dhammaan waxyaabaha aasaasiga ah ayaa lagu aqoonsan karaa hal mar iyada oo loo marayo qalooca dhalaalka.

4 Ma hubtaa in xaaladahaaga tijaabada ahi ay ku habboon yihiin?

SYBR waa in laga ilaaliyaa iftiin xoog leh, markaa isku day inaad damiso iftiinka sare markaad ku darayso reagent SYBR, oo kaliya waxaad u baahan tahay inaad isticmaasho iftiin yar si aad u dhamaystirto.

Ku kaydi SYBR at 4°C.Marka la isticmaalo, si tartiib ah kor iyo hoos u rogo si aad si fiican isugu walaaqdo si aad uga fogaato xumbo, si xoog lehna ha u rogin.

Qaar ka mid ah gabdhaha walaalaha ah waxay jecel yihiin inay calaamado ku sawiraan guddiga PCR-ga iyagoo ka baqaya in la isku qaso shaybaarrada, taas oo khalad ah.Sababtoo ah calaamadahaagu waxay aad ugu dhow yihiin inay saameeyaan ururinta calaamadaha fluorescent, waxaan guud ahaan kula talinayaa kuwa da'da yar inay isticmaalaan buugaag tijaabo ah si ay u caawiyaan xusuusta, sida hoos ku cad.

SawirkaqRT-PCR sawir qaade muunad

5 Ma hubtaa inaad saxan tahay?

Hubi inaad xidhato galoofyada, xidhato galoofyada, xidho galoofyada, oo aad saddex jeer sheegto waxyaalo muhiim ah.

Si loo yareeyo soo-gaadhista SYBR ee iftiinka, anigu shakhsi ahaan waxaan jeclahay in aan marka hore ku daro template, sida ka muuqata shaxanka hoose.Marka loo eego waayo-aragnimada, ku-darka qadar yar oo template ah waxay u badan tahay inay keento khaladaad muunad.Sidaa darteed, si loo yareeyo khaladka ay keento ku darista qadar yar oo template ah, inta badan waxaan labanlaabaa muunadda mar labaad, oo labanlaabmaa qadarka marka lagu daro muunada si loo yareeyo qadarka H2O2 ee lagu daray.

SawirkaJaantuska jaantuska ee qRT-PCR loading

Kadibna u habbee nidaamka qRT-PCR sida soo socota.

Sawirkajaantuska diyaarinta nidaamka qRT-PCR

FIIRO GAAR AH: Habka qaabaynta ayaa loo baahan yahay in lagu sameeyo baraf.

Ka dib markaad ku darto muunada, ku dheji filimka daboolka ah ee hufan.Isku day inaadan ku taaban dusha sare ee filimka daah-furnaanta gacmahaaga, kaliya ka shaqee meesha bannaan ee labada dhinac ee filimka.Sababtoo ah faraha faraha ayaa sidoo kale saameyn kara ururinta calaamadaha fluorescent.Ka dib isticmaal centrifuge si aad si degdeg ah sentrifuge 10 s xawaare hoose si aad uga hortagto in muunad ka laadlaad derbiga.

Alaabooyinka La Xiriira:

Qalabka tooska ah ee gacanta ee RT-qPCR

RT Fudud II