Sida mid ku cusub shaybaadhka, ma aha shaqo fiican in laga baadho dhirta togan ee farabadan dhirta leh heerka beddelka hooseeya.Marka hore, DNA waa in laga soo saaraa tiro badan oo muunado ah mid mid, ka dibna hiddo-wadaha ajnabiga ah waxaa ogaan doona PCR.Si kastaba ha ahaatee, natiijadu inta badan waa faaruq iyo xidhmo leh shay yar marmar, laakiin suurtagal maaha in la go'aamiyo haddii ay jiraan ogaansho la seegay ama ogaanshaha beenta ah..Ma tahay mid aan waxtar lahayn in la wajaho habka tijaabada ah iyo natiijooyinka?Ha werwerin, walaal waxa uu ku barayaa sida si fudud oo sax ah loo baadho dhirta togan.

Tallaabada 1

Naqshadaynta aasaasayaasha ogaanshaha

Go'aami hidda-wadaha endogenous iyo hiddo-wadaha dibadda ka ah si loo ogaado iyadoo loo eegayo muunadda la tijaabinayo, oo dooro wakiil 100-500bp isku xigxiga hiddo-wadaha naqshadaynta asaasiga ah.Aasaasayaasha wanaagsani waxay hubin karaan saxnaanta natiijooyinka ogaanshaha waxayna soo gaabin karaan wakhtiga ogaanshaha (eeg lifaaqa loogu talagalay aasaasayaasha ogaanshaha inta badan la isticmaalo).

Ogeysiis: Furayaasha cusub ee nashqadeeyay waxay u baahan yihiin inay hagaajiyaan xaaladaha falcelinta oo ay xaqiijiyaan saxnaanta, saxnaanta iyo xadka ogaanshaha ogaanshaha ka hor intaan la ogaanin baaxadda weyn.

Tallaabada 2

Nakhshad borotokoolka tijaabada ah

Xakamaynta togan: U isticmaal DNA-da la safeeyey ee ka kooban jajabkii yoolka qaab template ah si aad u go'aamiso in nidaamka falcelinta PCR iyo xaaladaha ay caadi yihiin.

Kontoroolka taban/madhan: Isticmaal template DNA ama ddH2O oo aan ku jirin jajabka bartilmaameedka qaab template ah si aad u ogaatid haddii ay jirto isha wasakhaysan nidaamka PCR.

Xakamaynta tixraaca gudaha: adeegso isku darka asaasiga ah/baarida hiddo-wadaha endogenous ee muunada si loo tijaabiyo si loo qiimeeyo in template-ka lagu ogaan karo PCR.

Ogaysiis:

Koontaroolada togan, taban/madhan iyo kantaroolka kantaroolka gudaha waa in loo dejiyaa imtixaan kasta si loo qiimeeyo ansaxnimada natiijooyinka tijaabada.

Diyaarinta tijaabada

Isticmaalka ka hor, u fiirso in xalku si siman isku qasan yahay.Haddii roobab la helo, waxay u baahan tahay in la kala diro oo la isku qaso si waafaqsan tilmaamaha ka hor inta aan la isticmaalin.Isku darka 2×PCR wuxuu u baahan yahay in la shubo oo lagu qaso si isdaba joog ah micropipette ka hor inta aan la isticmaalin si looga fogaado qaybinta aan sinnayn.

Ogaysiis:

Ka soo saar buug-gacmeedka oo si taxadar leh u akhri, oo samee diyaargarow ka hor tijaabada adigoo raacaya shuruudaha buug-gacmeedka.

Tallaabada 4

Diyaari nidaamka falcelinta PCR

Marka loo eego hab-maamuuska tijaabada, isku qas furayaasha, H2O, iyo 2×PCR si siman isku walaaq, sentrifuge oo u qaybi tuubo kasta oo falcelin ah.

Ogaysiis:

Baaritaanka baaxadda weyn ama midka fog, waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo nidaamka falcelinta PCR ee ka kooban UNG enzyme, kaas oo si wax ku ool ah uga fogaan kara wasakhowga hawada ee ay keenaan alaabta PCR.

Tallaabada 5

Ku dar qaabka falcelinta

Isticmaalka tignoolajiyada tooska ah ee PCR, looma baahna nidaamka nadiifinta aashitada nukliyeerka ee caajiska ah, tusaalaha muunada waxaa lagu diyaarin karaa 10 daqiiqo gudahood, waxaana lagu dari karaa nidaamka falcelinta PCR ee u dhigma.

Ogaysiis:

Habka jeexjeexa ayaa leh saameyn lagu ogaanayo oo wanaagsan, badeecada la helayna waxaa loo isticmaali karaa falcelino ogaansho badan.

5.1: Balaadhinta tooska ah ee caleemaha

Marka loo eego cabbirka sawirka buug-gacmeedka, gooyay unugyada caleenta dhexroorka 2-3mm oo ku rid nidaamka falcelinta PCR.

Fiiro gaar ah: Hubi in jajabyada caleentu ay si buuxda ugu dhex milmeen xalka falcelinta PCR, hana ku darin unug caleen ah oo xad dhaaf ah.

5.2: Habka caleen kala qaybinta

Iska yaree nudaha caleenta dhexroorkeedu yahay 5-7mm kuna rid tuubo centrifuge ah.Haddii aad doorato caleemaha bislaaday, fadlan iska ilaali inaad isticmaasho unugyada xididka weyn ee caleenta.Pipette 50ul Buffer P1 lysate geli tuubo centrifuge ah si loo hubiyo in lysate ay si buuxda u gelin karto unugyada caleenta, ku rid wareegga kuleylka ama qubeyska birta, iyo lyse at 95 ° C 5-10 daqiiqo.

Ku dar 50ul Buffer P2 xal dhexdhexaad ah oo si fiican u walaaq.lysate-ka soo baxay waxaa loo isticmaali karaa qaab tusaale ah waxaana lagu dari karaa nidaamka falcelinta PCR.

Fiiro gaar ah: Qadarka template wuxuu u dhexeeyaa 5-10% ee nidaamka PCR, waana inuusan dhaafin 20% (tusaale ahaan, nidaamka 20μl PCR, ku dar 1-2μl ee xalka lysis, oo aan ka badnayn 4μl).

Tallaabada 6

falcelinta PCR

Ka dib markii la isku koobo tuubada falcelinta PCR, waxaa la dhex dhigayaa qalabka PCR si loo kordhiyo.

Ogaysiis:

Dareen-celinta waxay isticmaashaa qaab-dhismeed aan la nadiifin si loo kordhiyo, markaa tirada wareegyada kordhinta waa 5-10 wareegyo ka badan marka la isticmaalayo template DNA oo la safeeyey.

Tallaabada 7

Ogaanshaha Electrophoresis iyo falanqaynta natiijada

M: 100bp DNA Salaanka

1\4: Habka DNA-da oo la sifeeyay

2\5: Habka tooska ah ee PCR

3\6: Xakamaynta bannaan

QC:

Natiijooyinka tijaabada ee kontaroolada kala duwan ee lagu dejiyay tijaabada waa inay buuxiyaan shuruudaha soo socda.Haddii kale, waa in la falanqeeyaa sababta dhibka keentay, baaritaanka waa in mar kale la sameeyaa ka dib marka dhibaatada la tirtiro.

Shaxda 1. Natiijooyinka imtixaanka caadiga ah ee kooxaha xakamaynta kala duwan

*Marka plasmid-ka loo isticmaalo xakameyn togan, natiijada baaritaanka hiddasidaha endogenous waxay noqon kartaa mid xun

Xukunka natiijada:

A. Natiijada baaritaanka hidda-wadaha endogenous ee muunadda ayaa ah mid taban, taasoo muujineysa in DNA-da ku habboon ogaanshaha PCR-ga caadiga ah aan laga soo saari karin muunadda ama DNA-da la soo saaray waxaa ku jira xakameynta falcelinta PCR, DNA-da waa in mar kale la soo saaro.

B. Natiijadda baaritaanka hidda-wadaha endogenous ee muunadda ayaa ah mid togan, natiijadii baaritaanka hidda-sidaha dibeddana waa taban, taasoo muujineysa in DNA-da ku habboon ogaanshaha PCR ee caadiga ah laga soo saaro muunadda, waxaana la qiimeyn karaa in hidde-sidaha XXX aan laga helin muunadda.

C. Natiijadda baaritaanka hidda-wadaha endogenous ee muunadda ayaa ah mid togan, natiijada baaritaanka hidde-sidaha dibedda ayaa ah mid togan, taasoo muujineysa in DNA-da ku habboon ogaanshaha PCR ee caadiga ah laga soo saaray muunadda, muunadda DNA-dana waxaa ku jira hiddasidaha XXX.Tijaabooyin xaqiijin ah ayaa la sii samayn karaa.

Tallaabada 8

Naqshadaynta aasaasayaasha ogaanshaha

Tijaabada ka dib, isticmaal 2% sodium hypochlorite solution iyo 70% ethanol xal si aad u tirtirto aagga tijaabada ah si looga hortago wasakhowga deegaanka.