一, Kordhi dareenka habka falcelinta:

1. Go'doomi RNA tayada sare leh:

Isku dhafka cDNA ee guusha leh wuxuu ka yimid RNA tayo sare leh.RNA tayada sare leh ugu yaraan waa in ay ahaataa mid dhererkeedu dhan yahay oo xor ka ah dib-u-horiyeyaasha transcriptase sida EDTA ama SDS.Tayada RNA ayaa go'aamisa tirada ugu badan ee xogta isku xigta ee aad u qori karto cDNA.Habka sifaynta caadiga ah ee RNA waa hab hal-tallaabo ah iyadoo la isticmaalayo guanidine isothiocyanate/acid phenol.Si looga hortago wasakheynta tirada RNase, RNA ka go'doonsan muunado qani ku ah RNase (sida beeryarada) waxay u baahan tahay in lagu kaydiyo formaldehyde si loo ilaaliyo RNA tayo sare leh, gaar ahaan kaydinta muddada dheer.RNA-da laga soo saaray beerka dooliga ayaa asal ahaan hoos u dhacday ka dib markii lagu kaydiyay biyaha muddo hal toddobaad ah, halka RNA-da laga soo saaray beeryarada jiirka ay ahayd mid deggan kadib markii lagu kaydiyay biyaha muddo 3 sano ah.Intaa waxaa dheer, qoraalada ka dheer 4 kb ayaa aad ugu nugul hoos u dhigista raadraaca RNases marka loo eego qoraallada yaryar.Si loo kordhiyo xasiloonida muunadaha RNA ee kaydsan, RNA waxa lagu milmi karaa formamide deionized waxaana lagu kaydin karaa -70°C.Formamide loo isticmaalo in lagu ilaaliyo RNA waa in uu ahaadaa mid ka xor ah qashinka wax-xumeeya RNA.RNA oo ka timaadda xameetida waxa lagu kaydin karaa foramide ugu yaraan hal sano.Markaad isku diyaarinayso isticmaalka RNA, waxaad isticmaali kartaa habka soo socda si aad u soo dejiso RNA: ku dar NaCl ilaa 0.2M iyo 4 jeer mugga ethanol, ku rid heerkulka qolka 3-5 daqiiqo, iyo centrifuge 10,000 × g 5 daqiiqo.

2. Adeegso qoraalka qoraalka ah ee RNaseH-aan firfircoonayn (RNaseH-):

Ka-hortaggayaasha RNase ayaa inta badan lagu daraa inay beddelaan falcelinta qoraalka si loo kordhiyo dhererka iyo dhalidda isku-dhafka cDNA.Kahortagayaasha RNase waa in lagu daraa inta lagu guda jiro falcelinta isku-darka-koowaad ee joogitaanka kaydiyaha iyo wakiilka yareeya (sida DTT), sababtoo ah habka kahor isku-darka cDNA wuxuu diidaa xannibaadaha, sidaas darteedna sii deynaya RNase-xidhan oo hoos u dhigi kara RNA.Protein RNase inhibitors kaliya waxay ka hortagaan hoos u dhaca RNA ee RNase A, B, C, kamana hortagaan RNase maqaarka, markaa ka digtoonow inaadan RNase ka soo galin farahaaga inkasta oo la isticmaalo ka hortagayaashan.

Reverse transcriptase waxay kicisaa u beddelka RNA una beddelo cDNA.Labada M-MLV iyo AMV labaduba waxay leeyihiin waxqabad RNaseH ah oo ay weheliso nashaadkooda polymerase.Dhaqdhaqaaqa RNaseH iyo dhaqdhaqaaqa polymerase ayaa midba midka kale kula tartamaya xargaha isku-dhafan ee ka dhex abuurmay template RNA iyo curiyaha DNA-ga ama xadhigga fidinta cDNA, oo hoos u dhigaya xargaha RNA ee RNA:DNA.Qaabka RNA ee uu hoos u dhigay dhaqdhaqaaqa RNaseH uma sii ahaan karo substrate wax ku ool ah isku-darka cDNA, kaas oo yareeya wax-soo-saarka iyo dhererka isku-dhafka cDNA.Sidaa darteed, waxay faa'iido u yeelan doontaa in la baabi'iyo ama si weyn loo yareeyo waxqabadka RNaseH ee qoraalka qoraalka ah.

SuperScript Ⅱ transcriptase gadaale, RNaseH- MMLV transcriptase beddelka ah iyo thermoScript reverse transcriptase, RNaseH-AMV, waxay heli kartaa xaddi ka badan iyo cDNA ka dherersan MMLV iyo AMV.Dareenka RT-PCR waxaa saameyn doona qadarka isku-dhafka cDNA.ThermoScript aad ayuu uga xasaasisan yahay AMV.Baaxadda alaabada RT-PCR waxaa xaddiday awoodda dib-u-celinta transcriptase si ay u abuurto cDNA, gaar ahaan marka la xidho cDNA-yada waaweyn.Marka la barbar dhigo MMLV, SuperScripⅡ waxay si weyn u kordhisay wax-soosaarka alaabada RT-PCR ee dheer.RNaseH-reverse transcriptase sidoo kale waxa uu kordhiyey heerkulbeegga, markaa falcelinta waxaa lagu samayn karaa heerkul ka sarreeya kan caadiga ah 37-42°C.Marka la eego shuruudaha isku-dhafka la soo jeediyay, isticmaal oligo(dT) furaha iyo 10 μCi ee [α-P] dCTP.Wadarta guud ee wax-soo-saarka xargaha kowaad waxaa la xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo habka roobabka TCA.Dhererka cDNA oo buuxa ayaa la falanqeeyay iyadoo la isticmaalayo xajmiyo kala duwan oo la jarjaray waxaana lagu tiriyaa jel agarose ah oo alkaline ah.

3. Kor u qaad heerkulka kuleejka si aad u qorto:

Heerkulka kor u kaca ayaa ka caawiya in la furo qaabka labaad ee RNA, kordhinta dhalidda falcelinta.Inta badan qaab-dhismeedka RNA, ku-buufinta RNA iyo alwaaxyada 65°C iyada oo aan lahayn wax kaydin ama milix ah, oo ay ku xigto qaboojinta degdega ah ee barafka waxay meesha ka saaraysaa badi qaab-dhismeedka sare waxayna u oggolaanaysaa furayaasha inay xidhaan.Si kastaba ha ahaatee, moodooyinka qaar ayaa weli leh qaab-dhismeedyo labaad, xitaa ka dib marka la diido kulaylka.Kordhinta qaab-dhismeedkan adag waxaa lagu samayn karaa iyadoo la isticmaalayo ThermoScript Reverse Transcriptase iyo dhigista falcelinta qoraalka gadaasha heerkul sare si loo hagaajiyo kor u qaadida.Heerkulka kulaylinta sare waxa kale oo ay kordhin kartaa qaas ahaanta, gaar ahaan marka asalka hidda-sidaha gaarka ah (GSP) loo isticmaalo isku-dhafka cDNA (eeg cutubka 3).Haddii aad isticmaalayso GSP, hubi in Tm-ga asaasiga ahi uu la mid yahay heerkulka la filayo.Ha isticmaalin oligo(dT) iyo qalabyada random ee ka sarreeya 60°C.Soosaarayaasha random-ka waxay u baahan yihiin in lagu tallaalo 25°C ilaa 10 daqiiqo kahor intaysan gaarin 60°C.Marka lagu daro isticmaalka heerkul-ku-soo-noqosho sare, gaar ahaanta waxaa sidoo kale lagu wanaajin karaa iyadoo si toos ah loogu wareejinayo isku dhafka RNA/saldhig heerkulka 65°C ee heerkulbeegga soo-qaadista iyo ku darida 2 × horay loo diiray oo falcelin ah (cDNA synthesis start-sup) .Habkani wuxuu kaa caawinayaa ka hortagga isku-xidhka saldhigga intermolecular ee ku dhaca heerkulka hoose.Bedelka heerkulka badan ee looga baahan yahay RT-PCR waxaa lagu fududayn karaa iyadoo la isticmaalayo wareegtada kulaylka.

polymerase Tth thermostable wuxuu u shaqeeyaa sidii DNA polymerase joogitaanka Mg2+ iyo sidii RNA polymerase marka uu joogo Mn2+.Waxa lagu ilaalin karaa kulaylka ugu badnaan 65°C.Si kastaba ha ahaatee, joogitaanka Mn2+ inta lagu jiro PCR waxay yaraynaysaa daacadnimada, taas oo ka dhigaysa Tth polymerase mid aan ku habboonayn kor u qaadida saxda ah ee saxda ah, sida cloning of cDNA.Intaa waxaa dheer, Tth waxay leedahay waxtarka qoraalka gadaasha hooseeya, taas oo yaraynaysa dareenka, iyo, maadaama dib-u-celinta iyo PCR lagu samayn karo hal enzyme, falcelinta xakamaynta iyada oo aan lahayn qoraal-celin celin ah looma isticmaali karo in la barbardhigo alaabada kor u qaadista cDNA iyo DNA-da wasakhaysan.Badeecadaha xoojinta waa la kala saaray.

4. Waxyaalaha lagu daro ee kor u qaada qoraal-celinta:

Waxyaalaha lagu daro oo ay ku jiraan glycerol iyo DMSO ayaa lagu daraa falcelinta falcelinta isku-dhafka ah ee ugu horreeya, taas oo yarayn karta xasilloonida laba-geesoodka aashitada nucleic-ka ah oo furfuraya qaabka labaad ee RNA.Ilaa 20% glycerol ama 10% DMSO waa lagu dari karaa iyada oo aan saameyn ku yeelan SuperScript II ama dhaqdhaqaaqa MMLV.AMV waxay sidoo kale u dulqaadan kartaa ilaa 20% glycerol iyada oo aan la lumin dhaqdhaqaaqa.Si kor loogu qaado dareenka RT-PCR ee SuperScriptⅡ falcelinta qoraalka dib u celinta, 10% glycerol ayaa lagu dari karaa oo lagu dari karaa 45°C.Haddii 1/10 ee badeecada falcelinta qoraalka dib loogu daro PCR, ka dibna diirada glycerol ee falcelinta xoojinta waa 0.4%, taas oo aan ku filnayn in la joojiyo PCR.

5. daawaynta RNaseH:

Daawaynta falcelinta isku dhafka cDNA ee RNaseH kahor PCR waxay kordhin kartaa dareenka.Qaar ka mid ah moodooyinka, waxaa loo maleynayaa in RNA ee falcelinta isku-darka cDNA ay ka hortagayso isku-xirnaanta alaabada xoojinta, taas oo daaweynta RNaseH ay kordhin karto dareenka.Guud ahaan, daawaynta RNaseH waa lagama maarmaan marka la kordhiyo dhererka dhererka buuxa ee cDNA qaab-dhismeedka bartilmaameedka, sida scherosis tuberous II koobiga hoose.Qaab-dhismeedkan adag, daawaynta RNaseH waxa ay xoojisay calaamada ay soo saartay SuperScript II ama cDNA-synthesized AMV.Inta badan falcelinta RT-PCR, daawaynta RNaseH waa ikhtiyaari, sababtoo ah tillaabada diidmada PCR ee 95°C waxay guud ahaan hadhisaa fayrasyada RNA ee RNA:DNA.

6. Horumarinta Habka Ogaanshaha RNA Yar:

RT-PCR waxay si gaar ah u dhib badan tahay marka xaddi yar oo RNA ah la heli karo.Glycogen oo lagu daray side ahaan inta lagu jiro go'doominta RNA waxay caawisaa inay kordhiso wax-soo-saarka muunado yaryar.Glycogen-free RNase waxaa lagu dari karaa isla mar marka lagu daro Trizol.Glycogen waa biyo milmay waxaana lagu hayn karaa wejiga biyaha leh RNA si loo caawiyo roobabka xiga.Shaybaarada wax ka yar 50 mg oo unug ah ama 106 unug dhaqan leh, fiirsashada lagu taliyey ee glycogen-free RNase waa 250 μg/ml.

Ku darista BSA acetylated ee falcelinta qoraalka qoraalka ah iyadoo la adeegsanayo SuperScript II waxay kordhin kartaa dareenka, iyo qadar yar oo RNA ah, hoos u dhigista qadarka SuperScript II iyo ku darida 40 unug ee RNaseOut nuclease inhibitor waxay kordhin kartaa heerka ogaanshaha.Haddii glycogen loo isticmaalo habka go'doominta RNA, wali waxaa lagu talinayaa in lagu daro BSA ama RNase inhibitor marka la isticmaalayo SuperScript II falcelinta qoraalka qoraalka.

Kor u qaad gaarka ah ee RT-PCR

1. CND Asynthesis:

Isku-dubaridka ugu horreeya ee cDNA waxa lagu bilaabi karaa iyadoo la isticmaalayo saddex hab oo kala duwan, gaar ahaan qaraabada taas oo saamaysa cadadka iyo nooca cDNA-da la farsameeyey.

Habka asaasiga ah ee random ayaa ahaa midka ugu yar ee saddexda hab.Qorshayaasha aasaasiga ah waxay tirtirayaan goobo badan oo dhan qoraalka qoraalka ah, iyagoo abuuraya cDNA-yo gaaban, oo qayb-dherer ah.Habkan waxaa inta badan loo isticmaalaa in lagu helo 5′ taxanaha dhamaadka iyo in laga helo cDNA laga soo qaado shaxanka RNA ee leh gobollo qaab dhismeed sare ah ama goobo joojin ah oo aan lagu soo celin karin qoraal-ku-noqosho.Si loo helo cDNA-da ugu dheer, saamiga asaasiga ah iyo RNA ee muunad kasta oo RNA ah ayaa loo baahan yahay in si macquul ah loo go'aamiyo.Diiradda bilawga ah ee curiyeyaasha random waxay u dhaxaysay 50 ilaa 250 ng falcelintii 20 μl.Maaddaama cDNA laga soo saaray wadarta RNA iyadoo la adeegsanayo aasaasayaasha random-ka ay ugu horrayn yihiin ribosomal RNA, poly(A)+RNA ayaa guud ahaan loo doortay qaab-dhismeedka.

Qorayaasha Oligo(dT) ayaa aad uga gaar ah kuwa asal ahaan ka soo jeeda.Waxay isku dhejisaa dabada poly(A) ee laga helo 3′ dhammaadka mRNA-yada eukaryotic.Sababtoo ah poly(A)+ RNA waa qiyaastii 1% ilaa 2% wadarta guud ee RNA, cadadka iyo kakanaanta cDNA aad bay uga yar tahay kuwa curiyayaasha random.Sababta oo ah gaar ahaanteeda sare, oligo(dT) guud ahaan uma baahna hagaajinta saamiga RNA ilaa aasaasayaasha iyo poly(A)+ xulashada.Waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo 0.5μg oligo(dT) nidaamkii falcelinta 20μl.oligo(dT)12-18 waxay ku haboontahay inta badan RT-PCR.Nidaamka ThermoScript RT-PCR wuxuu bixiyaa oligo(dT)20 sababtoo ah degenaanshaheeda kulaylka ee ka wanaagsan heerkulka kulaylinta sare.

Tilmaamaha gaarka ah ee hidda-wadaha (GSP) ayaa ah aasaasayaasha ugu gaarka ah ee tallaabada qoraalka qoraalka ah.GSP waa oligonucleotide-ka-hortagga ah kaas oo si gaar ah isku dhejin kara isku xigxiga bartilmaameedka RNA, si ka duwan aasaasiyaasha random ama oligo (dT), kaas oo soo jiidaya dhammaan RNA-yada.Xeerarka la midka ah ee loo isticmaalo qaabaynta asaasiga hore ee PCR ayaa lagu dabaqi karaa naqshadaynta GSP ee falcelinta qoraallada.GSP-gu waxa uu la mid noqon karaa isku xigxiga sida bilowga hore ee cod-weyneysiinta kaas oo ku sii qulqulaya 3′-dhamaadka mRNA, ama GSP waxa loo qaabayn karaa in lagu baab'iyo hoos-u-socodka dib-u-qaadista.Qaar ka mid ah maadooyinka la xoojiyay, in ka badan hal primer antisense ayaa u baahan in loo qaabeeyo si guul leh RT-PCR sababtoo ah qaabka labaad ee bartilmaameedka RNA wuxuu ka hortagi karaa xiritaanka asaasiga ah.Waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo 1 pmol antisense GSP gudaha 20 μl fal-celinta falgalka falgalka xudunta-koowaad.

2. Kor u qaad heerkulka kuleejka si aad u qorto:

Si looga faa'iidaysto faa'iidada buuxda ee gaarka ah ee GSP, qoraal-ku-noqosho leh heerkul sarreeya waa in la isticmaalaa.Heerkulka dib-u-dhaqaajinta kuleyliyaha ayaa lagu dari karaa heerkul sare si loo kordhiyo xajinta falcelinta.Tusaale ahaan, haddii GSP uu hoos u dhigo 55°C, gaar ahaan GSP si buuxda looma faa'iidaysan doono haddii AMV ama M-MLV loo isticmaalo qoraal gadaal ah oo xajin hoose ah 37°C.Si kastaba ha ahaatee, SuperScript II iyo ThermoScript waxaa lagaga falcelin karaa 50°C ama ka sareeya, taas oo meesha ka saaraysa badeecooyinka aan khaaska ahayn ee ka dhasha heerkulka hoose.Gaar ahaan ugu badnaan, isku dhafka RNA/primer-ka waxaa si toos ah looga wareejin karaa heerkulka 65°C ee heerkulbeegga soo-qaadista waxaana lagu daraa isku darka falcelinta 2× ee horay loo diiray (cDNA synthesis start hot).Tani waxay kaa caawinaysaa ka hortagga isku-xidhka saldhigyada intermolecular ee heerkulka hooseeya.Heerkulka kala-guurka badan ee looga baahan yahay RT-PCR waxaa lagu fududayn karaa iyadoo la isticmaalayo wareegga kulaylka.

3. Waxay yaraynaysaa wasakhowga DNA-da genomic:

Dhibaatada suurtagalka ah ee la kulma RT-PCR waa wasakheynta DNA-da genomic ee RNA.Isticmaalka habka go'doominta RNA ee wanaagsan, sida Trizol Reagent, waxay yarayn doontaa qadarka DNA-ga genomic ee wasakhaysan diyaarinta RNA.Si looga fogaado alaabada laga soo qaatay DNA-da genomic, RNA waxaa lagu daawayn karaa cod-weynayn-DNase I si looga saaro DNA-da wasakhaysan ka hor inta aan dib loo rogin.Dheefshiidka DNA-ga I waxa la joojiyay iyada oo shaybaarada lagu shubay 2.0mM EDTA 10 daqiiqo at 65°C.EDTA waxay jebin kartaa ion magnesium, ka hortagga RNA hydrolysis-ku-tiirsanaanta magnesium ee heerkulka sare.

Si loo kala saaro cDNA-da la xoojiyay ee wasakhaysan alaabada kordhinta DNA-da, asal-bixiyeyaasha waxaa loo qaabayn karaa in mid kastaaba uu kala saaro exons.Alaabooyinka PCR ee laga soo qaatay cDNA waxay ka gaaban doonaan kuwa laga soo qaatay DNA-da genomic ee wasakhaysan.Intaa waxaa dheer, tijaabo kontorool ah oo aan lahayn qoraal gadaal ah ayaa lagu sameeyay qaab-dhismeedka RNA kasta si loo go'aamiyo in jajab la bixiyay laga soo qaatay DNA-da genomic ama cDNA.Badeecada PCR ee la helay iyada oo aan loo rogin gadaal ayaa laga soo qaatay genome.