Fluorescence quantitative PCR (sidoo kale loo yaqaan TaqMan PCR, ka dib loo tixraaco FQ-PCR) waa tikniyoolajiyad cusub oo nukleic acid ah oo ay samaysay PE (Perkin Elmer) ee Maraykanka 1995. Farsamadan waxay ku salaysan tahay PCR-ga caadiga ah iyada oo lagu darayo shaybaarro calaamadeysan oo fluorescent ah.Marka la barbar dhigo PCR dabacsan, FQ-PCR waxay leedahay faa'iidooyin badan si loo xaqiijiyo hawsheeda tiradaMaqaalkani waxa uu doonayaa in uu si kooban u sharaxo sifooyinka, mabaadi'da, hababka, iyo isticmaalka farsamada.
1 Astaamaha
FQ-PCR ma aha oo kaliya inay leedahay dareenka sare ee PCR caadiga ah, laakiin sidoo kale sababtoo ah codsiga baaritaanka fluorescent, waxay si toos ah u ogaan kartaa isbeddelka calaamadaha fluorescent inta lagu jiro kor u qaadida PCR iyada oo loo marayo nidaamka korantada sawir-qaadista si loo helo natiijooyin tiro badan, taas oo ka gudubta cilladaha badan ee PCR-ga caadiga ah, sidaas darteed waxay sidoo kale leedahay qeexitaan sare oo ah isku-dhafka DNA-da iyo tignoolajiyada sare ee saxnaanta.
Tusaale ahaan, alaabta guud ee PCR waxay u baahan yihiin in lagu eego agarose gel electrophoresis iyo ethidium bromide oo leh nalka ultraviolet ama polyacrylamide gel electrophoresis iyo midab qalin ah.Tani kaliya uma baahna qalabyo badan, laakiin waxay sidoo kale qaadataa waqti iyo dadaal.Wasakhda loo isticmaalo Ethidium bromide waxay waxyeelo ku tahay jidhka bini'aadamka, hababkan tijaabada ah ee adag waxay siinayaan fursado wasakhaysan iyo wanaag been abuur ah.Si kastaba ha ahaatee, FQ-PCR waxay u baahan tahay oo kaliya inay furto furka hal mar inta lagu jiro rarka saamiga, iyo habka ku xiga ayaa si buuxda u xiran tuubbada, taas oo aan u baahnayn PCR-ga dib-u-socodka, isaga oo iska ilaalinaya dib-u-dhacyo badan oo ku yimaada hawlaha PCR ee caadiga ah.Tijaabada guud ahaan waxay isticmaashaa ABI7100 PCR kulaylka wareegga ee ay samaysay shirkadda PE.
Qalabku wuxuu leeyahay sifooyinka soo socda: ① Codsiga ballaaran: Waxaa loo isticmaali karaa DNA-da iyo RNA PCR-ga cabbirka alaabta, cilmi-baarista muujinta hidda-wadaha, ogaanshaha cudur-sidaha, iyo hagaajinta xaaladaha PCR.② Mabda'a qiyaaseed ee gaarka ah: Isticmaalka baarayaasha si cad u calaamadsan, qadarka fluorescence wuxuu ku urursan doonaa wareegga PCR ka dib kicinta laysarka, si loo gaaro ujeedada tirooyinka.③ Hufnaanta shaqo ee sare: Ku-dhismay 9600 PCR kulaylka wareegga, kombuyuutarku waxa la xakameeyey 1 ilaa 2 saacadood si loo dhamaystiro kordhinta iyo qiyaasida 96 muunadaha si toos ah oo isku mid ah.④ Looma baahna jel electrophoresis: Looma baahna in la milo iyo electrophoresis muunada, kaliya isticmaal baaritaan gaar ah si aad si toos ah ugu ogaato tuubada falcelinta.⑤Wasakh la'aan dhuumaha: Tuubbada falcelinta ee gaarka ah ee si buuxda u xidhan iyo nidaamka korantada korantada ayaa la qaatay, markaa looma baahna in laga walwalo wasakhowga.⑥Natiijooyinka waa la soo saari karaa: kala duwanaanshaha firfircoonida tirada waa ilaa shan amar oo cabbir ah.Sidaa darteed, tan iyo markii farsamadan si guul leh loo sameeyay, waxaa qiimeeyay cilmi-baarayaal badan oo cilmi-baaris ah waxaana lagu dabaqay dhinacyo badan.
2 Mabaadi'da iyo hababka
Mabda'a shaqada ee FQ-PCR waa in la isticmaalo 5'→3' dhaqdhaqaaqa exonuclease ee Taq enzyme si loogu daro baaritaan si fluorescent ah u calaamadsan nidaamka falcelinta PCR.Baadhitaanku waxa uu si gaar ah isugu qasi karaa qaabka DNA-da ee ku jira taxanaha hore.Dhammaadka 5'aad ee baaritaanka waxaa lagu calaamadeeyay hidda-wadaha qiiqa sii daaya FAM (6-carboxyfluorescein, qiiqa ugu sarreeya ee 518nm), iyo 3'dhamaadka waxaa lagu calaamadeeyay kooxda daminta fluorescence TAMRA phosphorylated si looga hortago in baaritaanka la kordhiyo inta lagu jiro PCR.Marka baaritaanku uu ahaado mid sax ah, kooxda dab-demiska waxay xakameysaa qiiqa qiiqa ee kooxda sii daaya.Marka kooxda qiiqa laga sooco kooxda deminta, xannibaadda ayaa kor loo qaadaa, cufnaanta indhaha ee 518nm way korodhaa waxaana lagu ogaadaa nidaamka ogaanshaha fluorescence. Marxaladda dib-u-dhaqaajinta, baadhitaanku wuxuu isku dhejiyaa qaabka DNA-ga, iyo Taq enzyme ee marxaladda kordhinta waxay u socotaa qaabka DNA-da oo leh kordhinta asaasiga ah.Marka baaritaanka la gooyo, saameynta deminta waa la sii daayaa waxaana la sii daayaa calaamadda fluorescent.Mar kasta oo qaab-dhismeedka la koobiyeeyo, baaraha waa la gooyaa, iyadoo ay la socoto sii daynta calaamadda fluorescent.Maadaama uu jiro xiriir hal-hal ah oo u dhexeeya tirada fluorophores ee la sii daayay iyo tirada alaabta PCR, farsamadan waxaa loo isticmaali karaa in si sax ah loo qiyaaso qaabka.Qalabka tijaabada ah wuxuu guud ahaan isticmaalaa ABI7100 PCR kulaylka wareegga ee ay samaysay shirkadda PE, iyo kuwa kale ee kulaylka ayaa sidoo kale la isticmaali karaa.Haddii habka falcelinta ABI7700 loo isticmaalo tijaabada, ka dib marka falcelinta la dhammeeyo, natiijooyinka tirada si toos ah ayaa loo bixin karaa iyada oo loo marayo falanqaynta kumbuyuutarka.Haddii aad isticmaasho wareegyada kulaylka kale, waxaad u baahan tahay inaad isticmaashid qalabka wax sheegta si aad u cabbirto calaamada fluorescence ee tuubada falcelinta isku mar si aad u xisaabiso RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ waxay ka dhigan tahay saamiga xoogga luminescence ee kooxda qiiqa qiiqa ee tuubada muunada ilaa xoogga iftiinka kooxda deminta, RQ- waxay ka dhigan tahay saamiga labada ee tuubada bannaan, △ RQ (△ RQ = RQ + - RQ-) waxay u taagan tahay qadarka natiijada xogta fluorescence ee la heli karo inta lagu guda jiro isbeddelka xogta PC-ga.Sababo la xiriira hordhaca ah ee shaybaarrada fluorescent, gaar ahaan tijaabada si weyn ayaa loo hagaajiyay.Nakhshadeynta baaritaanka guud ahaan waa in ay la kulantaa shuruudaha soo socda: ① Dhererka baaritaanku waa inuu ahaadaa qiyaastii 20-40 saldhig si loo hubiyo gaar ahaan xiritaanka.②Waxyaabaha ku jira saldhigyada GC waxay u dhexeeyaan 40% iyo 60% si looga fogaado isku-duubnida taxanaha nukliyeerka.③ Ka fogow isku-dhafka ama isku-ku-darka waxyaabaha aasaasiga ah.④ Xasiloonida isku xidhka udhaxeeya baaritaanka iyo qaab-dhismeedka ayaa ka wayn xasiloonida isku xidhka udhaxeeya furaha iyo template, markaa qiimaha Tm ee baadhitaanku waa inuu ahaadaa ugu yaraan 5 ° C ka sarreeya qiimaha Tm ee asaasiga ah.Intaa waxaa dheer, xoogga saarista baaritaanka, isku midka ah ee u dhexeeya baaritaanka iyo isku xigxiga template, iyo masaafada u dhaxaysa baaritaanka iyo asaasiga ah dhamaantood waxay saameyn ku yeeshaan natiijooyinka tijaabada.
Alaabta la xidhiidha:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Saaraha iyo Soo saaraha Taqman |Foregene (foreivd.com)
Waqtiga boostada: Oct-15-2021
