Tijaabooyinka qPCR, naqshadeynta asaasiga ah sidoo kale waa xiriiriye aad muhiim u ah.Haddi ay aasaasayaashu ku haboon yihiin iyo in kale waxay si dhow ula xidhiidhaan in waxtarka kordhintu uu gaadhay heerka, haddii alaabta la xoojiyay ay gaar yihiin, iyo haddii natiijooyinka tijaabada la heli karo.
Marka sidee looga dhigayaa qaPCR qaaska ahaanshaha si ka wanaagsan?Waxtarka sare-u-qaadista?
Maanta, waxaan ku geyn doonaa inaad si wadajir ah u naqshadeyso aasaasayaasha qPCR, oo aan u oggolaano naqshadeynta qPCR inay noqoto xirfad wax ku ool ah oo tijaabo ah.
Marka la naqshadeynayo qPCR, sida caadiga ah fiiro gaar ah u yeelo qodobbada soo socda: asaasiga ah waa in lagu qaabeeyaa gudaha gudaha inta ugu badan ee suurtogalka ah, dhererka alaabadu waa inuu ahaadaa 100-300 bp, qiimaha Tm waa inuu ahaadaa mid u dhow sida ugu macquulsan 60 ° C, iyo muraayadaha kor iyo hoosba waa inay ahaadaan kuwa ugu dhow ee suurtogalka ah, iyo dhamaadka ra'yiga waa inuu ahaado G ama C, iwm.
1. Nakhshad aasaasiyaal ah oo ku dhereran introns
Marka la naqshadeynayo aasaasayaasha qPCR, doorashada aasaasayaasha loo qaabeeyey guud ahaan gudaha gudaha waxay ka hortagi kartaa qaabka gDNA in la kordhiyo, alaabadana dhammaantood waxay ka soo jeedaan kor u qaadista cDNA, sidaas darteed meesha looga saaro saameynta wasakheynta gDNA.
2. Dhererka asaasiga ah
Dhererka asaasiga ahi guud ahaan wuxuu u dhexeeyaa 18-30 nt, iyo dhererka alaabada kordhinta waa in la xakameeyaa inta u dhaxaysa 100-300 bp intii suurtagal ah.
Haddi primer-ku uu aad u gaaban yahay, waxay u horseedi doontaa kor u qaadis aan gaar ahayn, iyo haddii ay aad u dheer tahay, waxay si fudud u samayn doontaa qaab-dhismeedka labaad (sida qaab-dhismeedka timaha).Haddii alaab-weyneyntu ay aad u dheer tahay, kuma habboona falcelinta polymerase, taas oo saameyn doonta waxtarka kor u qaadista PCR.
3. Nuxurka GC iyo qiimaha Tm
Waxa ku jira GC-da curiyayaasha waa in lagu xakameeyaa inta u dhaxaysa 40% iyo 60%.Haddii ay aad u sarreeyso ama aad u hooseyso, kuma habboona in la bilaabo falcelinta.Nuxurka GC ee hore iyo gadaalba waa in ay u dhawaadaan isku mid si loo helo isla qiimaha Tm iyo heerkulka soo jiidashada.
Qiimaha Tm waa inuu ahaadaa inta u dhaxaysa 55-65°C ilaa inta suurtogalka ah, guud ahaan ku dhawaad ​​60°C, iyo qiimaha Tm ee kor iyo hoosba waa inuu ahaadaa mid u dhow sida ugu macquulsan, door bidaan in aanu ka badnayn 4°C.
4. Ka fogow inaad doorato A ee 3′ dhamaadka furaha
Marka dhamaadka 3′ ee furaha aan la is waafajin, waxaa jira farqi weyn oo u dhexeeya hufnaanta isku dhafka saldhigyada kala duwan.Marka saldhigga ugu dambeeya uu yahay A, waxay sidoo kale bilaabi kartaa isku-dhafka silsiladda xitaa haddii ay dhacdo is-waafajin, iyo marka saldhigga ugu dambeeya uu yahay T Marka , waxtarka is-waafajinta is-waafajinta ayaa si weyn loo yareeyaa.Sidaa darteed, isku day inaad iska ilaaliso inaad doorato A ee 3′ dhamaadka furaha, waxaana fiican inaad doorato T.
Haddi ay tahay furaha baadhitaanka, 5′ dhamaadka baadhitaanku ma noqon karo G, sababtoo ah xitaa marka hal saldhig G lagu xidho kooxda weriyaha ee FAM fluorescent, G waxa kale oo uu demin karaa calaamada fluorescent ee ay sii daysay kooxda FAM, taasoo keentay natiijooyin taban oo been ah.Muuqda
5. Qaybinta saldhiga
Qaybinta afarta saldhig ee asaasiga ah ayaa la doorbidayaa si aan kala sooc lahayn, iyada oo laga fogaanayo in ka badan 3 G ama C oo isku xigta dhammaadka 3', iyo in ka badan 3 isku xigta.G ama C way fududahay in la sameeyo isku xidhka gobolka isku xigxiga ee qani ku ah GC.
6. Gobolka naqshadeynta asaasiga ahi waa inuu ka fogaadaa dhismooyinka sare ee adag.
Qaab dhismeedka labaad ee ay samaysay hal xadhig oo ka mid ah alaab-weynaynta ayaa saamayn doonta horumarka siman ee PCR.Adiga oo saadaaliyay haddii ay jirto qaab-dhismeedka labaad ee isku xigxiga bartilmaameedka ka hor, isku day inaad ka fogaato gobolkan qaabeynta asaasiga ah.
7. Furayaasha laftooda iyo kuwa u dhexeeya aasaasayaasha waa inay isku dayaan inay ka fogaadaan saldhigyo is-kaabaya oo isku xiga.
Ma jiri karo 4 isku xigta oo dhammaystirka aasaasiga ah ee u dhexeeya aasaasaha laftiisa iyo furaha.Qulqulaha laftiisa waa inuusan yeelanin isku xigxig dhammaystiran, haddii kale waxay isku laaban doontaa si ay u sameyso qaab-dhismeedka timaha, taas oo saameyn doonta isku-dhafka xoqidda ee asaasiga ah iyo qaabka.
Taxanayaal dhammaystiran kama dhex jiri karaan qormayaasha sare iyo kuwa hoose.Dhammaystirka udhaxeeya aasaasayaasha ayaa soo saari doona dimers primer, kaas oo yareyn doona waxtarka PCR oo xitaa saameyn doona saxnaanta tirada.Haddi qaab dhismeedka timaha-dimer-ka iyo biinanka aan laga fursan karin, △G qiimaha waa inuusan aad u sareyn (waa inuu ka yaraado 4.5 kcal/mol).
8. Asal-dhigayaashu waxay xoojiyaan badeecada gaarka ah ee la beegsanayo.
Hadafka ugu dambeeya ee ogaanshaha qPCR waa in la fahmo tirada badan ee hidda-wadaha bartilmaameedka ah.Haddii cod-weyneyn aan gaar ahayn dhacdo, tiradu waxay noqonaysaa mid khaldan.Sidaa darteed, ka dib markii la naqshadeeyay aasaasayaasha, waxay u baahan yihiin in lagu tijaabiyo BLAST, iyo waxyaabaha gaarka ah ee alaabooyinka waxaa lagu barbar dhigaa xogta taxanaha.
Marka xigta, waxaan soo qaadaneynaa GAS6 (xiritaan kobac gaar ah oo 6) hiddo-wadaha tusaale ahaan si loo naqshadeeyo aasaasayaasha qPCR.
01 hiddo-wadaha weydiinta
Homo GAS6iyada oo loo marayo NCBI.Halkan, waa in aan fiiro gaar ah u leenahay isbarbardhigga magaca hidda-wadaha iyo noocyada si loo hubiyo in ay yihiin kuwo joogto ah.
02 Soo hel taxanaha hiddo-wadaha
(1) Haddii taxanaha bartilmaameedku yahay DNA-da genomic, dooro kan ugu horreeya, kaas oo ah taxanaha DNA-da genomic ee hiddasidaha.
(2) Haddii taxanaha bartilmaameedku yahay mRNA, dooro kan labaad.Kadib markaad gasho, dhagsii "CDS" shaxda hoose.Taxanaha asalka brown waa isku xigxiga codeing ee hiddasidaha.
03 Naqshadeeyayaasha
Geli is dhexgalka Primer-BLAST
Geli nambarka isku xigxiga hiddo-wadaha ama isku xigxiga qaabka Fasta ee bidixda sare, oo buuxi xuduudaha khuseeya.

Guji "Hel aasaasiyaal" oo NCBI ayaa soo bixi doonta si ay kuu sheegto in xulashada cabbirka noocaas ah lagu kordhin doono noocyo kala duwan oo kala duwan.Waxaan hubin karnaa kala duwanaanshaha kala-goynta kala duwan oo aan u gudbin karno si aan u helno lammaanaha asaasiga ah ee ku habboon (sida ku cad shaxanka hoose).Habkani waxa uu qaadan karaa tobanaan ilbiriqsi si uu u socdo.
Heerkulka lamaanahan asaasiga ahi waa ku dhawaad ​​60°C.Marka loo eego ujeedada tijaabada, dooro aasaasayaasha leh dherer dhexdhexaad ah, gaar ah oo wanaagsan iyo is-kaabasho yar oo ka mid ah aasaasayaasha tijaabada, iyo heerka guushu waa mid aad u sarreeya!
04 Xaqiijinta gaarka ah ee hore
Dhab ahaantii, marka lagu daro naqshadaynta asaasiga ah, Primer-Blast waxa kale oo uu qiimeyn karaa aasaasayaasha aan nafteena naqshadeynay.Ku soo laabo bogga naqshadaynta asaasiga ah, geli furayaasha sare iyo kuwa hoose ee aan nashqadnay, xuduudaha kale lama hagaajin doono.Ka dib markaad gudbiso, waxaad arki kartaa in labada lamaane ay sidoo kale ku jiraan hiddo-wadaha kale.Haddii dhammaantood lagu soo bandhigo hidda-wadaha waxaan rabnaa inaan kor u qaadno , taasoo muujineysa in gaar ahaanshaha lamaanahan asaasiga ahi ay weyn yihiin!(Tusaale ahaan, tani waa natiijada kaliya ee weydiinta asaasiga ah!)

05 Xukunka tayada aasaasiga ah
Nooc noocee ah ayaa ah aasaasaha "fiican" ee isku dara "wax ku oolnimada kor u qaadida ilaa heerka", "sifaadka alaabta la xoojiyay", iyo "natiijooyinka tijaabada ah ee la isku halayn karo"?
Hufnaanta kordhinta

qalooca dhalaalaysa
Hufnaanta wax-soo-saarka ee asaasiga ah waxay gaartaa 90% -110%, taas oo macnaheedu yahay in waxtarka kor u qaadida uu wanaagsan yahay, qalooca dhalaalku wuxuu leeyahay hal ugu sarreeya oo badanaa Tm> 80 ° C, taas oo macnaheedu yahay in si gaar ah u-weyneyntu ay wanaagsan tahay.
 
Alaabooyinka La Xiriira:
Waqtiga dhabta ah PCR Easy-SYBR GREEN I
Waqtiga dhabta ah PCR Easy-Taqman