RT-qPCR waa tijaabada aasaasiga ah ee bayoolaji molecular, qof walbana waa inuu yaqaanaa.Inta badan waxa ku jira saddex tillaabo: soo saarista RNA, dib u qorida cDNA, iyo wakhtiga dhabta ah ee fluorescent PCR.Waxba ma tarto, maxaa dhacaya?Waxay u badan tahay inay dhibaato ka jirtotijaabada qoraalka gadaal!In kasta oo ay u muuqato in tijaabada dib-u-dejinta ay u baahan tahay oo keliya in lagu daro RNA, dNTP, primers, iyodib u rogidaTuubada centrifuge oo si fiican isku qas, laakiin habka dhabta ah ee hawlgalka, weli waxaa jira faahfaahin badan oo u baahan in fiiro gaar ah loo yeesho.Aan wax ka baranno!

Sidee loo qiimeeyaa tayada RNA?
Si loo helo cDNA, tayada RNA waa muhiim!Tayada RNA waxaa lagu ogaan karaa inta badan laba dhinac:
(1) daacadnimada RNA:daacadnimada RNA waxaa lagu xaqiijin karaa agarose gel electrophoresis. Qaadashada eukaryotes tusaale ahaan, wadarta guud ee RNA oo dhamaystiran waxay leedahay saddex qaybood oo cad, miisaannada molecular ee waaweyn ilaa yar waa 28S, 18S, iyo 5S, iyo 28S waxay laba jeer ka dhalaalaysaa 18S;haddii saddex qaybood la arki karo, laakiin nooca band waa guduudan yahay ama Faafiddu waxay ka dhigan tahay in RNA qayb ahaan hoos u dhacday.Waqtigan xaadirka ah, fadlan si degdeg ah u samee falcelinta qoraalka qoraalka oo si habboon u kordhi gelinta template;Haddii koox leh miisaan yar oo unugyo ah ama aan la arki karin, RNA gabi ahaanba waa la dhimay oo waxay u baahan tahay in dib loo soo saaro.Agilent 2100 waxay tusinaysaa daacadnimada RNA oo leh jaantuska ugu sarreeya iyo qiimaha RIN.Haddii aashitada nucleic-ka ah ay saxsan tahay, saldhigga korantada ee electropherogram waa mid siman;haddii aashitada nucleic-ka ah ay si aad ah u hoos u dhacdo, salka ayaa ah mid aan sinnayn oo hoos u dhac badan ayaa muuqda;Qiimaha RIN wuxuu ka tarjumayaa daacadnimada RNA, inta u dhaxaysa 0-10, qiimaha weyn, ayaa ka sii wanaagsan tayada RNA.Waa hagaag, heerka sare ee dhammaystirka.
(2) Daahirnimada RNA:Saamiga OD260/280 waxaa lagu ogaan karaa UV spectrophotometry.Haddii saamiga OD260/280 uu u dhexeeyo 1.9 iyo 2.1, nadiifnimadu aad bay u wanaagsan tahay.
DNA-da genomic ee hadha waxay u horseedi kartaa natiijooyin tiro aan sax ahayn
Marka RNA la soo saaro, RNA aan helno waxaa laga yaabaa in lagu qaso genomic DNA (gDNA) oo aan la nadiifin.Sidaa darteed, cDNA ka dib qoritaanka gadaasha ayaa sidoo kale lagu qasi doonaagDNA.Inta lagu jiro qulqulka hooseqPCRfalcelin,CDNAiyo gDNA waxaa laga yaabaa in si isku mar ah loo kordhiyo, taasoo keeneysa qiimo yar oo CT ah, markaa natiijadu waxay noqon kartaa eex.
Haddaba maxaan yeelnaa xaaladdan?Foregenewaxay soo jeedinaysaa:
(1) Ku samee nadiifinta genome ee RNA rogantay, kaas oo laga saari karo soo saarista tiirka inta lagu jiro soo saarista RNA;
(2) Ku dawee RNA la soo saaray DNA-daI , laakiin ku jooji EDTA;
ee reagents transcription gadaashaoo leh modules nadiifinta genome;

Sidee loo doortaa furayaasha qorista gadaal?
Qoraaga dib u noqoshada ayaa sidoo kale saameeya natiijada falcelinta qoraalka qoraalka.Waxaad dooran kartaa asal-raacyo random-ka ah, Oligo dT ama aasaasayaasha hidda-sidaha u gaarka ah si loogu beddelo qoraallada iyadoo loo eegayo duruufaha gaarka ah ee tijaabada:
(1) Qoraallo gaar ahDaawooyinka hidde-sidaha gaarka ah ayaa lagula talinayaa;
(2) Qoraallo goos goos dheer ah: Oligo dT/saldhigyada gaarka ah ayaa lagula talinayaa;
(3) Jajabka gudaha ee qoraallada qaybta-dheer: Aasaasayaasha hiddo-sidaha gaarka ah/ asal-raacyada random-ka-soo-baxa ah + Oligo dT.Haddii tijaabada qPCR ee soo socota la sameeyo, Oligo dT lama isticmaali karo kaligiis, sababtoo ah isticmaalka Oligo dT oo keliya ayaa laga yaabaa inay keento 3′ dhammaadka eexda, taasoo horseedaysa natiijooyin tijaabo ah oo qPCR ah;
(4) miRNA: Asal-dhigayaasha stem-loop ama curiyeyaasha dabada ayaa la isticmaali karaa.

Immisa jeer ayay tahay in cDNA-da badeecada la beddelo lagu qaso qiyaas ahaan?
Ka dib markii la helo cDNA ee alaabta dib u duubista, inta jeer ee cDNA ay tahay in lagu qaso tijaabooyinka qPCR waa mid aad muhiim u ah.Haddii fiirsashada cDNA ay aad u sarreyso ama aad u hooseyso, waxtarka kordhinta ayaa laga yaabaa in la saameeyo.Ma la qiyaasi karaa fiirsashada cDNA, sideese loo sameeyaa?
(1) Diiradda cDNA ee badeecada dib-u-celinta lama qiyaasi karo, sababtoo ah marka lagu daro sheyga cDNA, badeecada dib-u-celinta waxay sidoo kale ka kooban tahay nuqul ka-noqosho ah Buffer, reverse transcriptase, primers, iwm.Waqtigaan, saaxiibada qaar ayaa dhihi doona, ka dibna waxaan cabbiri doonaa xoojinta ka dib markii la nadiifiyo;Halkan, Foregene wuxuu jeclaan lahaa in uu xasuusiyo in cDNA aan lagu talineynin in la nadiifiyo, sababtoo ah dhererka cDNA ee la helay dib u noqoshada waa ka duwan yahay, cDNA gaaban ayaa lumin doonta nadiifinta.
(2) Haddaba maxaa la sameeyaa?Kahor tijaabada qPCR, qulqulka milanka cDNA waxaa lagu go'aamin karaa tijaabada hore.Tusaale ahaan: isticmaal xalalka kaydka cDNA, qaso 10-laab ah, iyo 100-laab qasitaan ahaan qaab moodello loogu talagalay tijaabooyinka qPCR, oo dooro cunsurrada milanka leh qiimaha CT inta u dhaxaysa 18-28.

Sidee miRNA-yada loo rogi karaa?
miRNA waa unug yar oo RNA ah oo hal xadhig leh oo cabirkiisu yahay 22 nt kaas oo aan codeeyn borotiinka.Sababtoo ah dhererkeeda gaaban, habka qPCR ee caadiga ah way adagtahay in si toos ah loo qiyaaso, sidaas darteed inta badan waa lagama maarmaan in la kordhiyo miRNA;Hababka dib-u-celinta ee caadi ahaan loo isticmaalo miRNA waxaa ka mid ah habka stem-loop iyo habka dabada.
Habka stem-loop waa in la dheereeyo miRNA iyadoo lagu darayo aasaasayaasha stem-loop.Habkan ogaanshaha waxa uu leeyahay dareen sare oo gaar ah, laakiin wax soo saarka ogaanshaha waa yar yahay.Hal qoraal oo gadaal ah ayaa kaliya lagu ogaan karaa hal miRNA iyo tixraac gudaha ah;Habka dabada-ku-darku wuxuu ka kooban yahay laba Waxaa lagu dhammeeyaa ficil wadajir ah oo ah laba enzymes, kuwaas oo ah PolyA polymerase iyo transcriptase gadaal.PolyA polymerase ayaa mas'uul ka ah in ay ku darto dabada PolyA miRNA si ay u kordhiso dhererkeeda, iyo transcriptase gadaalku wuxuu sameeyaa falcelin qoraal ah.Habkani waxa uu leeyahay soo saarista ogaanshaha sare oo lagu ogaan karo miRNA-yo badan iyo tixraacyo gudaha ah hal qoraal oo gadaal ah, laakiin dareenka iyo gaarnimada ayaa ku yar habka stem-loop.