Nadiifinta talooyinka pipette iyo tuubooyinka EP, iwm.
1. U diyaari 0.1% (kun meel) DEPC (walax aad u sun ah) oo leh biyo deionized, si taxadar leh ugu isticmaal daboolka qiiqa, oo ku kaydi meel 4°C ka fog iftiinka;
Biyaha DEPC waa biyo saafi ah oo lagu daaweeyay DEPC waxaana lagu jeermis dilay heerkul sare iyo cadaadis sare.La tijaabiyay in uu xor ka yahay RNase, DNA iyo proteinase.
2. Geli caarada pipette iyo tuubada EP 0.1% DEPC, oo hubi in caarada pipette iyo tuubada EP ay ka buuxaan 0.1% DEP.
3. Ka ilaali iftiinka, ha istaagto, habeen dhaxay (12-24h)
4. Sanduuqa ay ku jiraan caarada iyo tuubada EP uma baahna in lagu qooyo DEPC.Ka dib markaad si qiyaas ah uga saartid biyaha DEPC ee caarada ama tuubada EP, xir oo duub.
5. 121 darajo Celsius, 30min
6. 180 darajo Celsius, qallaji dhowr saacadood (ugu yaraan 3 saacadood)
Fiiro gaar ah: a.Xiro galoofyada cinjirka ah iyo maaskaro marka aad gacanta ku hayso DEPC!b, ama aan lahayn jeermiska DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (shaybaaro badan oo heerkul sare ah oo jeermis dilay)
Tixgelinta soo saarista RNA
Laba dhacdo oo waaweyn oo ah nudaha go'doominta RNA oo guuldarraystay
Burburinta RNA iyo hadhaaga wasakhda unugyada,xagga xaalufka, aynu marka hore eegno sababta RNA laga soo saaray unugyada dhaqanku aanay si fudud u hoos u dhicin.Soosaarayaasha RNA ee jira dhamaantood waxay ka kooban yihiin qaybo si degdeg ah u joojiya RNase.Ku dar lysate unugyada dhaqanka, oo si fudud u walaaq, dhammaan unugyada si fiican ayaa loogu qasi karaa lysate, unugyaduna si buuxda ayaa loo nadiifiyaa.Ka dib marka unugyada la nadiifiyo, maaddooyinka firfircoon ee lysate waxay isla markiiba joojiyaan RNase intracellular, sidaas darteed RNA waxay ahaanaysaa mid sax ah.Taasi waa in la yiraahdo, sababtoo ah unugyada dhaqameedku si sahlan oo buuxda ayay ula xiriiraan lysate, RNA-gooda si fudud uma dhimin;Dhanka kale, RNA ee nudaha ayaa si fudud u hoos u dhacaya sababtoo ah unugyada unugyada ma fududa inay si dhakhso ah ula xiriiraan lysate.xiriir ku filan awgeed.Haddaba,Iyadoo loo maleynayo inay jirto hab loogu rogo unugyada unugyada hal unug iyadoo la joojinayo dhaqdhaqaaqa RNA, dhibaatada hoos u dhaca ayaa si buuxda loo xalin karaa.
Dhaqdhaqaaqa nitrogen ee dareeraha ah ayaa ah habka ugu waxtarka badan.Si kastaba ha ahaatee, habka wax lagu shiilo ee nitrogen dareeraha ah ayaa ah mid aad u dhib badan, gaar ahaan marka tirada shaybaaradu ay badan yihiin.Tani waxay keentay waxa ugu fiican ee soo socda: homogenizer.ThehomogenizerHabka ma tixgeliyo su'aasha ah sida dhaqdhaqaaqa RNase loo joojiyo ka hor inta aan unugyada lala xiriirin lysate, laakiin waxay ku tukadaan in heerka khalkhalka unugyada uu ka dhaqso badan yahay heerka RNase intracellular uu hoos u dhigo RN.
Saamaynta homogenizer korantada ayaa ka fiican,iyo saamaynta homogenizer galaas waa liidata, laakiin guud ahaan, habka homogenizer ma ka hortagi karo ifafaale xaalufka.Sidaa darteed, haddii soo-saarku uu xumaado, homogenizer-ka asalka ah ee korantada waa in loo isticmaalaa in lagu shiido nitrogen dareere ah;homogenizer dhalada asalka ah waa in loo beddelaa homogenizer koronto ama si toos ah loogu shiiday nitrogen dareere ah.Dhibaatadu waxay ku dhowdahay 100% macquul ah.la xaliyo.
Dhibaatada haraaga wasakhda ah ee saameeya tijaabooyinka xiga waxay leedahay sababo kala duwan marka loo eego hoos u dhaca, xalalkuna waa u dhigma kala duwan.Gabagabadii,Haddii ay jiraan nabaad-guur ama wasakh haraaga ah oo ku jira nudaha, habka soo saarista/reagenta walxaha gaarka ah ee tijaabada ah waa in la hagaajiyo.Uma baahnid inaad u isticmaashid muunadaada qaaliga ah si aad u wanaajiso: waxaad ka iibsan kartaa qaar ka mid ah xayawaanka yar yar sida kalluunka/digaagga suuqa, qaado qaybta u dhiganta walxaha soo saarista RNA, iyo qaybta kale ee soo saarista borotiinka - ku shiid afka, caloosha iyo mindhicirka.
Bartilmaameedka RNA ee RNA-ga la soo saaray ayaa loo isticmaalaa tijaabooyin kala duwan oo dabagal ah, shuruuda tayadadeeduna way ka duwan tahay
Dhismaha maktabadda cDNA waxay u baahan tahay daacadnimada RNA iyada oo aan la helin hadhaaga falcelinta falcelinta enzyme;Waqooyiga waxay u baahan tahay daacadnimada RNA sare iyo shuruudaha hoose ee hadhaaga falcelinta falcelinta enzyme;RT-PCR uma baahna daacadnimo RNA aad u sareysa,laakiin waxay joojisaa falcelinta enzyme.Shuruudaha hadhay waa adag yihiin.Gelitaanka ayaa go'aaminaya wax soo saarka;Mar kasta oo hadafku yahay in la helo RNA daahirsanaanta ugu sarreeya, waxay ku kici doontaa dadka iyo lacagta.
Ururinta/Kaydinta Muunooyinka
Waxyaalaha Saamaynaya Nabaad-guurka Ka dib markii muunadku ka baxo jidhka noolaha/ama deegaanka koritaanka asalka ah, enzymes endogenous ee muunada waxay bilaabi doonaan inay hoos u dhigaan RNA,iyo heerka xaalufku wuxuu la xidhiidhaa waxa ku jira enzymes endogenous iyo heerkulka.Dhaqan ahaan, waxaa jira laba siyaabood oo kaliya oo si buuxda loo joojin karo dhaqdhaqaaqa enzyme endogenous: ku dar lysate isla markiiba oo si fiican oo degdeg ah isku mid ah;jarjar qaybo yaryar oo isla markiiba ku qabooji nitrogen dareeraha ah.Labada habba waxay u baahan yihiin hawlgal degdeg ah.Kan dambe wuxuu ku habboon yahay dhammaan shaybaarrada, halka kan hore uu ku habboon yahay oo keliya unugyo leh maaddo hoose oo unugyo ah iyo enzymes endogenous oo ay fududahay in la isku mideeyo.Gaar ahaan, unugyada dhirta, beerka, thymus, beeryarada, beeryarada, maskaxda, baruurta, unugyada murqaha, iwm. ayaa sida ugu fiican loogu qaboojiyey nitrogen dareere ah ka hor intaanay socon.
Kala qaybsanaanta iyo isu-ekaanshaha shaybaarrada
Waxyaalaha Saameeya Nabaad-guurka iyo Wax-soo-saarka Tusaalaha kala qaybsanaantu waasi dhammaystiran isku-duubnida, kaas oo si buuxda oo dhammaystiran loo sii daayo RNA.Unugyada si toos ah ayaa loo midayn karaa iyada oo aan la jabin.Unugyada waxaa la isku mid noqon karaa ka dib marka la jebiyo.Khamiirka iyo bakteeriyada waxay u baahan yihiin in lagu jebiyo enzymes u dhigma ka hor inta aan la isku mid ahayn.Unugyada leh enzyme endogenous hoose iyo isku-soo-bax fudud ayaa la burburin karaa oo la isku mid noqon karaa hal mar lysate by homogenizer ah;unugyada dhirta, beerka, thymus, beeryarada, beeryarada, maskaxda, baruurta, unugyada muruqa iyo muunado kale, Waxay ku badan yihiin insaymes endogenous ama aan si fudud isku mid ah.sidaas darteed khalkhal gelinta unugyada iyo isku-duubnida waa in si gaar ah loo sameeyaa.Habka ugu kalsoonida badan uguna wax soo saarka badan ee kala qaybsanaantu waa shiididda nitrogen dareere ah, iyo habka ugu kalsoonaan karo ee isku-dhafka waa isticmaalka homogenizer koronto.Qoraal gaar ah oo ku saabsan shiididda nitrogen dareeraha ah: muunadda waa in aan la dhalaalin inta lagu jiro habka wax-shiididda oo dhan, maadaama enzymes endogenous ay u badan tahay inay shaqeeyaan marka la qaboojiyo.
Doorashada lysate
Saamaynta ku habboonaanta hawlgalka iyo arrimaha haraaga wasakhda endogenous Xalka caadiga ah ee la isticmaalo waxay ku dhowaad joojin karaan dhaqdhaqaaqa RNase.Sidaa darteed, qodobka ugu muhiimsan ee doorashada xalka lysis waa in la tixgeliyo marka lagu daro habka nadiifinta.Waxaa jira hal ka reeban:shaybaarada leh maaddada endogenous enzyme sare ayaa lagula talinayaa in la isticmaalo lysate ka kooban phenol si loo kordhiyo awoodda in ay firfircoonayn enzymes endogenous.
Doorashada habka nadiifinta
Waxyaabaha saameeya wasakhda haraaga ah ee haraaga ah, xawaaraha soo saarista shaybaarada nadiifka ah sida unugyada, natiijooyin lagu qanco ayaa laga heli karaa ku dhawaad hab kasta oo nadiifin ah oo gacanta lagu hayo.Laakiin muunado kale oo badan, gaar ahaan kuwa leh heerar sare oo wasakh ah sida dhirta, beerka, bakteeriyada, iwm, doorashada habka nadiifinta ku habboon ayaa muhiim ah.Habka nadiifinta centrifugal tiirka wuxuu leeyahay xawaare soosaar degdeg ah wuxuuna si wax ku ool ah uga saari karaa wasakhaha saameeya falcelinta enzymatic ee soo socota ee RNA, laakiin waa qaalihalkan;iyadoo la adeegsanayo hababka nadiifinta dhaqaale iyo kuwa caadiga ah, sida roobabka LiCl, waxay sidoo kale heli karaan natiijooyin lagu qanco, laakiin wakhtiga qalliinku waa dheer yahay..
"Saddex edbin iyo Siddeed Feejignaan" ee soo saarista RNA
Anshaxa 1:Jooji faddaraynta enzymes dibadda ah.
Xusuusin 1:Si adag u xidh maaskaro iyo galoofyada.
Xusuusin 2:Tuubooyinka centrifuge, madax tip, ulaha pipette, taangiyada electrophoresis, iyo kuraasta tijaabada ah ee ku lug leh tijaabada waa in si fiican loo tuuro.
Xusuusin 3:Reagents/xalalka ku lug leh tijaabada, gaar ahaan biyaha, waa inay ahaadaan kuwo ka madax banaan RNase.
Anshaxa 2:Jooji hawsha enzymes endogenous
Xusuusin 4:Dooro hab isku mid ah oo habboon.
Xusuusin 5:Dooro lysate ku habboon.
Xusuusin 6:Xakamee cadadka bilawga muunada.
Anshaxa 3:Caddee ujeedada soo saaristaada
Xusuusin 7:Nidaam kasta oo lysate ah oo ku soo dhowaanaya xaddiga bilowga ugu sarreeya ee muunada, heerka guusha soo saarista ayaa si aad ah hoos ugu dhacaysa.
Xusuusin 8:Halbeegga dhaqaale ee kaliya ee soo saarista RNA ee guuleysta waa guusha tijaabooyinka xiga, ee maaha wax-soo-saar.
10ka Ilaha ee ugu Sareeya Wasakhowga RNase
1. Faruhu waa isha ugu horeysa ee laga helo enzymes-ka baxsan, markaa galoofyada waa in la xidhaa oo la beddelaa si joogto ah.Intaa waxaa dheer, waji-xidhka waa in sidoo kale la xiraa, sababtoo ah neefsashadu sidoo kale waa isha muhiimka ah ee enzymes.Faa'iidada dheeraadka ah ee xirashada maaskaro galoofis waa in la ilaaliyo tijaabiyaha.
2. Talooyinka pipette, tuubooyinka centrifuge, pipettes - RNase laguma dhaqaajin karo nadiifinta oo keliya, markaa talooyinka pipette iyo tuubooyinka centrifuge waa in lagu daaweeyaa DEPC, xitaa haddii lagu calaamadeeyay sida DEPC loo daweeyay.Way fiicantahay in la isticmaalo pipette ujeedo gaar ah, ku tirtir 75% suuf alkolo ah ka hor intaan la isticmaalin, gaar ahaan usha;Intaa waxaa dheer, iska hubi inaadan isticmaalin qalabka madaxa ka saara.
3. Biyuhu waa inay ka xoroobaan sumowga RNase.
4. Ugu yaraan miiska tijaabada waa in lagu tirtiraa 75% alkolo suuf ah.
5.Endogenous RNase Dhammaan unugyadu waxa ay ka kooban yihiin enzymes endogenous, markaa barafaynta degdega ah ee unugyada leh nitrogen dareeraha ah ayaa ah habka ugu fiican ee lagu dhimi karo xaalufka.Habka kaydinta nitrogen dareeraha ah/shiidida runtii waa mid aan habooneyn, laakiin waa habka kaliya ee unugyada leh heerarka sare ee enzymes endogenous.
6. Muunada RNA alaabada soo saarta RNA waxa ku jiri kara raad sumowga RNase.
7. Soo saarista Plasmid Soo saarista Plasmid waxay inta badan isticmaashaa Rnase si ay u hoos u dhigto RNA, iyo Rnase haraaga waa in lagu shiidiyaa Proteinase K oo laga soo saaro PCI.
8. Kaydinta RNA Xataa haddii lagu kaydiyo heerkul hoose, cadadka RNase ee raadku waxay sababi doontaa nabaad-guurka RNA.Xalka ugu fiican ee ilaalinta muddada-dheer ee RNA waa milix/alkolo joojin, sababtoo ah aalkoladu waxay joojisaa dhammaan dhaqdhaqaaqa enzymatic heerkulka hooseeya.
9. Marka cations (Ca, Mg) ay ku jiraan ion kuwan, kuleylinta 80C ee 5 daqiiqo waxay keenaysaa in RNA la dillaaco, markaa haddii RNA loo baahan yahay in la kululeeyo, xalka ilaalinta wuxuu u baahan yahay inuu ku jiro wakiilka chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).
10. Enzymes loo isticmaalo tijaabooyinka xiga waxa laga yaabaa in ay sumoobaan RNase.
10 Talooyin loogu talagalay Soo saarista RNA
1: Si degdeg ah uga hortag dhaqdhaqaaqa RNase.Muunooyinku si dhakhso ah ayaa loo qaboojiyaa ururinta ka dib, RNasena waxa ay hawlgelisaa qalliin degdeg ah inta lagu jiro lysis.
2: Dooro habka soo saarida ku haboon ee nudaha leh maadada ribozyme sare leh, iyo adipose tissue ayaa ugu fiican in la isticmaalo habka uu ku jiro phenol.
3: Tayada saadaalintu waxay u baahan tahay Waqooyiga, dhismaha maktabadda cDNA waxay u baahan tahay daacadnimo sare, iyo RT-PCR iyo RPA (Ribonuclease ilaalinta assay) uma baahna daacadnimo sare.RT-PCR waxay u baahan tahay nadiif sare (hadhaaga enzyme inhibitor).
4: Isku-duubnida saxda ah waa furaha hagaajinta wax-soo-saarka iyo dhimista xaalufka.
5: Hubi daacadnimada RNA electrophoresis ogaanshaha, 28S: 18S = 2: 1 waa calaamad dhamaystiran, 1: 1 sidoo kale waa la aqbali karaa inta badan tijaabooyinka.
6: Ka-saarida DNA-da RT-PCR, falanqaynta array Way fiicantahay in la isticmaalo DNA I si loo saaro DNA.
7: Iska yaree wasakheynta enzymes-ka-baxsan - Enzymes lagama soo dejin karo dibadda.
8: Marka xooga la saarayo aashitada nucleic-ka ah ee xooga yar, waa in lagu daraa reagent co- roobab.Laakiin si looga hortago isku-darka ka kooban enzymes iyo wasakheynta DNA-da.
9: Si fiican u milmi RNA, haddii loo baahdo, kuleyl 65C 5 daqiiqo.
habka kaydinta ku habboon
Waxa lagu kaydin karaa -20C wakhti gaaban, iyo -80C wakhti dheer.Talaabada ugu horeysa ee lagu wanaajinayo wax soo saarka RNA waa in la ogaado in waxa ku jira RNA ee muunado kala duwan ay aad u kala duwan yihiin.Fara badan (2-4ug/mg) sida beerka, xameetida, wadnaha, xaddi dhexdhexaad ah (0.05-2ug/mg) sida maskaxda, embriyaha, kelyaha, sambabada, thymus, ugxan-yar, xaddi yar (<0.05ug/mg) mg) sida kaadiheysta, lafaha, baruurta.
1: Unugyada Lyse si loo sii daayo RN - haddii RNA aan la sii deyn, wax-soo-saarka waa la dhimi doonaa.homogenization koronto shaqeeya si ka fiican hababka kale ee homogenization, laakiin sidoo kale laga yaabaa in ay u baahan tahay in lagu daro habab kale, sida shiidida nitrogen dareere ah, dheefshiidka enzymatic (Lysozyme/Lyticase)
2: Hagaajinta habka soo saarista.Dhibaatooyinka ugu waaweyn ee hababka phenol-ku-salaysan waa qaabaynta aan dhamaystirnayn iyo qayb luminta RNA (ka sarreeya gabi ahaanba lama saari karo).Qalabaynta aan dhamaystirnayn waxaa sabab u ah aashitada nucleic ah oo sarreeya iyo borotiinka, taas oo lagu xallin karo kordhinta qadarka lysate ee la isticmaalo ama la yareeyo tirada muunada.Tallaabo ah soo saarista chloroform ayaa lagu daray unugyada adipose.Luminta RNA waxaa lagu yarayn karaa dib-u-pumping ama in la saaro lakabka organic oo ay ku xigto centrifugation.Dhibaatada ugu weyn ee hababka centrifugation-ku-saleysan tiirka waa muunad xad-dhaaf ah.
Talooyin Soo saarista Classic
1. Nadiifinta Phenol: Ku dar mug le'eg oo ah 1:1 phenol/Chloroform oo si adag u qas ilaa 1-2 daqiiqo.Centrifuge xawaare sare 2 daqiiqo.Si taxadar leh uga saar maadada sare (80-90%).Waligaa ha gaadhin lakabka dhexe.Mugga siman ee xal-celinta falcelinta ayaa lagu dari karaa phenol/Chloroform waxaana laga saarayaa maadada sare.Labada supernatant ayaa la isku dari karaa si loo helo roobka aashitada nucleic si loo hagaajiyo wax soo saarka.Ha noqon mid aad u jilicsan marka aad isku qaseyso, hana isku dayin inaad ka saarto dhammaan waxyaabaha ka sarreeya.
2. Ku dhaqida ethanol 70-80%: Inta lagu jiro dhaqidda, aashitada nucleic-ka ah waa in la hakiyaa si loo hubiyo in milixda haraaga ah ay meesha ka baxdo.Isla mar ahaantaana, isla markiiba ka dib markaad ku shubto ethanol-ka, centrifuge xawaare sare dhowr ilbiriqsi, ka dibna ka saar ethanol haraaga leh pipette.Kala dir ka dib markaad istaagto heerkulka qolka 5-10 daqiiqo.
11. Soo saarista ururada gaarka ah
1. Nudaha Fibrous: Furaha ka soo saarida RNA ee unugyo fibrous ah sida wadnaha/muruqa lafaha waa in si buuxda loo carqaladeeyo nudaha.Unugyadani waxay leeyihiin cufnaanta unug yar, sidaas darteed qadarka RNA ee miisaanka unug kasta waa hooseeyaa, waxaana fiican in la isticmaalo inta ugu badan ee bilawga ah ee suurtogalka ah.Hubi inaad si fiican u shiiddo nudaha xaaladaha qaboojinta.
2. Unugyo leh borotiin/baruur sare: Maskaxda/maskaxda dufanka khudaarta ku jira ayaa aad u sareysa.Ka dib marka PCI la soo saaro, dusha sare wuxuu ka kooban yahay floccules cad.Daawada sare waa in dib loogu soo saaraa chloroform.
3. Unugyo leh nukleic acid/ribozyme sare: beeryarada/thymus waxay leedahay nukleic acid iyo ribozyme sare.Burburinta unugyada hoostooda xaaladaha qaboojinta oo ay ku xigto isku-duubnida degdega ah waxay si wax ku ool ah u joojin kartaa ribozymes.Si kastaba ha ahaatee, haddii lysate aad u viscous ah (sababtoo ah content nucleic acid sare), saarista PCI ma awoodi doonaan in ay si hufan u habayn;ku darida lysate dheeraad ah ayaa xallin karta arrintan.Soo saaris badan oo PCI ah ayaa ka saari kara DNA-ga haraaga badan.Haddii roob cad uu sameeyo isla markiiba ka dib marka lagu daro khamriga, waxay muujinaysaa wasakheynta DNA-da.Dib-u-soo-saarista PCI acidic ka dib kala diri waxay ka saari kartaa wasakheynta DNA.
4. Nudaha dhirta: Unugyada dhirta ayaa ka dhib badan unugyada xoolaha.Guud ahaan, dhirtu waxay ku hoos jirtaa xaalado nitrogen dareere ah, sidaa darteed nabaad-guurka RNA ee enzymes endogenous waa wax aan caadi ahayn.Haddii dhibka hoos u dhaca aan la xalin, waxaa hubaal ah in ay sabab u tahay wasakhda ku jirta muunada.Wasakhda ku jirta dhir badan ayaa u horseedi doonta hadhaaga, sababta haraagana inta badan waa sababta oo ah wasakhdaani waxay la mid tahay RNA: adaa soo dagdaga oo waan soo dadajiyaa, adiguna adsorb oo anigu waan ku adkeysanayaa.Tilmaamahani waxay go'aamiyaan inay yihiin kuwo aad u xoog badan oo xannibaya enzymes.
Waqtigan xaadirka ah, reagents-soo-saarka RNA-ganacsiga ayaa la waafajin karaa ku dhawaad dhammaan unugyada xoolaha oo leh hagaajinno yaryar, laakiin waxaa jira dhowr reagents soosaar RNA ganacsi ah oo ku habboon inta badan unugyada dhirta.Nasiib wanaag, Foregene waxay bixin kartaa gaar ahxirmooyinka soo saarista RNA dhirta, waxaan leenahayQalabka go'doominta ee RNA Total, Qalabka Go'doominta Dhirta ee RNA Plus.Ka dambe waxaa si gaar ah loogu talagalay dhirta leh polysaccharide sare iyo polyphenol.Soo saarista RNA, jawaab celinta isticmaalayaasha shaybaadhka ayaa si gaar ah u wanaagsan.
12. Saamaynta qaboojinta iyo dhalaalida muunada barafaysan ayaa laga yaabaa inay ka weynaato, waxayna u baahan tahay in la gooyo ka hor inta aan loo isticmaalin soo saarista RNA.Muunadodu waxay u muuqdaan inay dhalaalaan (malaha qayb ahaan) inta lagu jiro jarida.Muunado la qaboojiyey ayaa laga yaabaa inay u baahdaan in la miisaamo ka hor inta aan la soo saarin RNA, dhalaalina xaqiiqdii waxay dhici doontaa inta lagu jiro hawshan.Mararka qaarkood, dhalaalidda muunadda waxay sidoo kale dhacdaa inta lagu jiro habka wax-shiidka ee nitrogen dareeraha ah;ama muunada la qaboojiyey ayaa si toos ah loogu daraa lysate iyada oo aan la helin dareeraha nitrogen-ka, iyo dhalaaliddu waxay hubaal ahaan dhici doontaa ka hor inta aan la dhammaystirin isku-dhafka.Tijaabooyinku waxay muujiyeen in nudaha la qaboojiyey ay aad ugu nugul yihiin nabaad-guurka RNA inta lagu jiro dhalaalidda unugyada cusub.Sababta ay u badan tahay: Geedi socodka baraf-dhalantu waxa uu carqaladeeyaa qaab-dhismeedka unugga dhexdiisa, taas oo u sahlaysa in enzymes endogenous in ay si toos ah ula xidhiidhaan RNA.
13. Xukunka tayada RNA Sida caadiga ah, electrophoresis waxaa loo isticmaalaa in lagu xukumo daacadnimada RNA, iyo A260/A280 ayaa loo isticmaalaa in lagu xukumo daahirnimada RNA.Aragti ahaan, RNA dhawrsan waxay leedahay saamiga 28S: 18S = 2.7: 1, inta badan xogta waxay xooga saartaa saamiga 28S: 18S = 2: 1.Xaqiiqdu waxay tahay in ku dhawaad midkoodna RNA laga soo saaray muunado aan ahayn unugyadu aanu ku jirin saamiga 2:1 (tan waxa la helay iyadoo la isticmaalayo Agilent Bioanalyzer).
Natiijooyinka electrophoresis ee RNA waxaa saameeya arrimo badan, oo ay ku jiraan qaab-dhismeedka sare, xaaladaha electrophoresis, load muunad, heerka buuxsamay by EB, iwm. Isticmaal electrophoresis hooyo si aad u ogaato RNA iyo isticmaalka DNA Summada sida kontorool.Haddii 28S ee 2kb iyo 18S ee 0.9kb ay cad yihiin, iyo 28S: 18S> 1, daacadnimadu waxay buuxin kartaa shuruudaha tijaabooyinka xiga.
A260/A280 waa tilmaame keenay jahawareer badan.Ugu horreyntii, waa lagama maarmaan in la caddeeyo macnaha asalka ah ee tilmaamayaashan ee acids nucleic: RNA saafi ah, A260/280 = qiyaastii 2.0.RNA saafi ah waa 'sababta' iyo A260/A280 = 2 waa 'saamaynta'.Hadda qof kastaa wuxuu u isticmaalayaa A260/A280 'sababo', isagoo u maleynaya "haddii A260/A280 = 2, markaa RNA waa saafi", taas oo dabiiciyan keenta jahawareer.
Haddii aad xiisaynayso, waxaad ku dari kartaa reagen yar oo inta badan loo isticmaalo soo saarista, sida phenol, guanidine isothiocyanate, PEG, iwm., muunada RNA-gaaga, ka dibna cabir saamiga A260/A280.Xaqiiqdu waxay tahay in qaar badan oo ka mid ah reagen-yada loo isticmaalo soo saarista RNA, iyo sidoo kale wasakh badan oo ku jira muunada, waxay nuugaan agagaarka A260 iyo A280, oo saameeya A260/A280.
Habka ugu waxbarasho badan ee hadda waa in la iska sawiro shaybaarka RNA ee cabbirka 200-300 nm.Qallooca RNA saafiga ah wuxuu leeyahay sifooyinka soo socda: qalooca waa siman yahay, A230 iyo A260 waa laba dhibcood oo is-rogid, A300 waxay ku dhowdahay 0, A260/A280 = agagaarka 2.0, iyo A260/A230 = agagaarka 2.0.Haddii xogta iskaanka aan la heli karin, saamiga A260/A230 waa in sidoo kale la go'aamiyaa, maadaama saamigani uu aad ugu nugul yahay qaadista dhammaan wasakhooyinka saameeya falcelinta enzymatic.Tixgeli kala duwanaanshaha tooska ah ee aaladda (0.1-0.5 ee A260).
Waxaa jira laba dhacdo oo kale oo faa'iido leh: saamiga wuxuu noqon doonaa qiyaastii 0.3 hoose marka A260/A280 lagu cabbiro biyaha;halka saamiga lagu qiyaasay 10 mM EDTA uu ku saabsan yahay 0.2 ka sarreeya kan lagu qiyaasay 1 mM EDTA.
Alaabta la xidhiidha:
Taxanaha go'doominta RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Waqtiga boostada: Jul-15-2022
