PCR, badan PCR, In goobta PCR, Dib u celi PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Waxaan xallin doonaa fikradaha, tillaabooyinka iyo faahfaahinta PCR kala duwan

Ⅰ. PCR

Falcelinta Silsiladda Polymerase, ee loo yaqaan PCR, waa tignoolajiyada noole-kuleelaha oo loo isticmaalo in lagu ballaariyo jajabyada DNA-da gaarka ah.Waxa loo tixgalin karaa sidii DNA-ga gaarka ah ee ku-noqoshada gudaha vitro.DNA polymerase (DNA Polymerase I) ayaa la helay horraantii 1955, iyo Klenow Fragment of E. Coli, oo leh qiime tijaabo ah iyo wax ku ool ah, waxaa daahfuray Dr. H. Klenow horraantii 1970-meeyadii, laakiin sababtoo ah enzymkani uma dulqaadan karo heerkulka, heerkulka sare ayaa hoos u dhigi kara, sidaas darteed ma buuxinayso falcelinta silsiladda polymerase ee heerkulka sare.Enzymes-yada maanta la isticmaalo (oo loo yaqaan Taq polymerase), ayaa laga soocay Thermus aquaticus, bakteeriyada guga kulul sannadkii 1976. Sifadeeda ayaa ah in ay iska caabin karto heerkulka sare waana enzyme ku habboon, laakiin si weyn ayaa loo isticmaalaa wixii ka dambeeyay 1980-yadii.Fikradda asalka ah ee prototype-ka asalka ah ee PCR waxay la mid tahay hagaajinta hidda-wadaha iyo koobiyaynta, kaas oo uu soo jeediyay Dr. KJell Kleppe 1971. Waxa uu daabacay nuqulkii hidde-sidaha fudud iyo muddada gaaban ee ugu horreeya (oo la mid ah labadii fal-celinta wareegga hore ee PCR).PCR-ka maanta la sameeyay waxaa sameeyay Dr. Kary B. Mullis sanadkii 1983. Dr. Mullis waxa uu u adeegay shirkadaha PE sanadkaas, marka PE waxa ay maqaam gaar ah ku leedahay warshadaha PCR.Dr. Mullis ayaa si rasmi ah u daabacay warqadii ugu horeysay ee la xiriirta Saiki iyo kuwa kale 1985. Tan iyo markaas, isticmaalka PCR waa kumanaan mayl maalintii, tayada waraaqaha la xidhiidha ayaa la odhan karaa waxay sameeyaan habab kale oo badan oo cilmi-baaris ah oo aan la jeclayn.Ka dib, tignoolajiyada PCR waxaa si weyn loogu isticmaalaa cilmi baarista sayniska noolaha iyo codsiyada kiliinikada, taasoo noqoneysa tignoolajiyada ugu muhiimsan ee cilmi baarista bayoolajiga molecular.Mullis waxa kale oo uu ku guulaystay 1993 Nobel Prize in Chemistry.

PCRMabda'a

Mabda'a aasaasiga ah ee tignoolajiyada PCR waxay la mid tahay habka dib-u-celinta dabiiciga ah ee DNA-da, gaar ahaana waxay ku xiran tahay asaasiga oligonucleotide kaas oo kaabaya labada daraf ee taxanaha bartilmaameedka.PCR waxay ka kooban tahay hoos-u-dhac-xumaynta-kordhinta saddex tillaabo falcelin aasaasi ah: ① Degeneration of template DNA: Ka dib DNA template la kululeeyo ilaa 93°C muddo cayiman, xalka DNA-ga ee dual-silsiladda DNA ee uu sameeyay PCR-weynaynta DNA-da, ka dhig hal silsilad si loogu diyaariyo falcelinta wareegga xiga si loogu daro falcelinta wareegga xiga.②Annealing (compound) ee template DNA iyo primer: Ka dib marka template DNA la kululeeyo oo uu xumaaday hal silsilad, heerkulku hoos u dhaco ilaa 55°C.Taxanaha dhammaystirka ah ee asaasiga ah iyo qaab-dhismeedka DNA-da hal-silsilad-hal-abuurka ah.③ Kordhinta furaha: Qaabka DNA-ku xidhidhiyaha asaasiga ahi wuxuu ku salaysan yahay ficilka TaqDNA polymerase, oo leh dNTP sida walxaha ceeriin ee falcelinta.Hayso mabda'a ku-noqoshada, isku-dubbaridi silsilad nuqul ka mid ah oo cusub oo buuxinaysa silsiladda DNA-ga, oo ku celi wareegga-xumaynta-jilicsanaanta-kordhinta saddex hab-socodka waxay heli kartaa "silsilad koobi ah oo badhkeed ah", silsiladdan cusubna waa la heli karaa mar kale noqo qaab-dhismeedka wareegga xiga.Waxay qaadataa 2-4min in la dhamaystiro wareegga, hidde-sidaha bartilmaameedka waxaa lagu kordhin karaa dhowr milyan jeer 2-3 saacadood gudahood.

HeerkaPCRNidaamka falcelinta

Shan walxood oo falcelinta PCR ah

Inta badan waxaa jira shan nooc oo walxo ah oo ku lug leh falcelinta PCR, kuwaas oo kala ah primer, enzyme, dNTP, template iyo buffer (Mg2+ ayaa loo baahan yahay).[Nidaamka PCR]

Habka caadiga ah ee PCR waxa loo qaybiyaa saddex tallaabo

1. Degeneration DNA (90°C-96°C): Qaababka DNA-da ee laba-silsilad ah ee hoos yimaada ficilka kulaylka, curaarta hydrogen jebiya, samaynta DNA-ga silsilad-hal ah.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Heerkulka nidaamka waa la dhimay, furaha waxaa lagu daraa template DNA si loo sameeyo silsilad laba-jibbaaran.

3. Kordhinta (70 ℃ -75 ℃): Marka la eego ficilka Taq enzyme (qiyaastii 72 ° C, hawsha ugu fiican), dNTP waxaa loo isticmaalaa sida alaabta ceeriin, oo ka socota dhammaadka 5' ee asaasiga ah → 3' dhammaadka, isku-dhafka iyo template waxay isku buuxiyaan silsiladda DNA kale.

Wareeg kasta waa la jeexjeexay, la tirtiray oo la dheereeyey, taas oo labanlaabaysa nuxurka DNA-da.Waqtigan xaadirka ah, iyada oo ay ugu wacan tahay aagga cod-weyneysiinta gaaban, qaar ka mid ah PCR ayaa lagu soo celin karaa wakhti aad u yar xitaa haddii dhaqdhaqaaqa Taq enzyme uusan fiicnayn, markaa waxaa loo beddeli karaa laba tallaabo, taas oo ah, nuugista iyo kordhinta waxaa lagu samayn karaa 60 ° C-65 ° C isku mar.Si loo yareeyo habka qaadista iyo qaboojinta loona hagaajiyo xawaaraha jawaabta.

Tilmaamaha falcelinta PCR

● Gaar ahaan-sare

Qodobbada go'aaminta gaarka ah ee jawaabta PCR waa: ①Isku darka gaarka ah ee asaasiga ah iyo DNA-ga template.②Mabda'a lammaanaynta salka.③ Daacadnimada falcelinta isku-darka TaqDNA polymerase.④ Gaar ahaan iyo dhawrsanaanta hidde-sidaha bartilmaameedka ah.

Isku dhafka saxda ah ee furayaasha iyo qaababka ayaa ah furaha.Isku-xidhka asaasiga ah iyo qaabka iyo fidinta silsiladda asaasiga ah waxay ku saleysan yihiin mabda'a isku-dhafka saldhigga alkaline.Daacadnimada falcelinta isku-dhafka polymerase iyo iska caabbinta heerkulka sare ee Taq DNA polymerase si loo sameeyo isku-xidhka (compound) ee template iyo furaha falcelinta waxaa lagu samayn karaa heerkul sare.Gaar ahaan isku-dhafka ayaa si weyn u kordhay.Muuqaalku wuxuu ilaalin karaa saxnaanta heerka sare.Adiga oo dooranaya gobolka hidde-sidaha bartilmaameedka ah ee leh ilaalinta sare iyo ilaalinta sare, gaar ahaantiisa ayaa sarreeya.

● Dareen sare

Mugga wax soo saarka ee alaabta PCR waxaa lagu kordhiyey index, kaas oo ballaarin kara qaabka bilowga ah ee Picker (PG=10-12) si loo kordhiyo heerka microcontroller ilaa heerka micrograms (μg= -6).Unugyada bartilmaameedka ah waxaa laga ogaan karaa 1 milyan unug;ogaanshaha fayrasyada, dareenka PCR wuxuu gaari karaa 3 RFUs (meelo madhan oo la sameeyay cutubyo);heerka ugu yar ee lagu ogaan karo cilmiga bakteeriyada waa 3 bakteeriyada.

● Fudud oo Degdeg ah

Fikradda PCR waxay isticmaashaa heerkulka sare ee Taq DNA polymerase, kaas oo ku daraya xalalka falcelinta hal mar, taas oo ah, falcelinta-xumaynta-anneal-fidinta ee xalka xoojinta DNA iyo dheriga qubeyska biyaha.Guud ahaan, falcelinta kordhinta waxay ku dhammaataa 2 ilaa 4 saacadood.Badeecooyinka la kordhiyey waxaa guud ahaan lagu falanqeeyaa seef koronto, mana aha inay isticmaalaan isotopes, ma jirto wasakh shucaac ah, iyo dhiirrigelin fudud.

● Nadiifadda muunada ayaa hooseysa

Looma baahna in la kala saaro fayraska ama bakteeriyada iyo unugyada dhaqanka.Alaabada DNA-ga ceyriinka ah iyo RNA waxaa loo isticmaali karaa cod-weyneyaal ahaan.Baadhista DNA-da ayaa si toos ah loo isticmaali karaa iyadoo la isticmaalayo muunado caafimaad sida dhiiga, dareeraha jidhka, dareeraha qufaca, timaha, unugyada, iyo unugyada noolaha.

PCRdhibaatooyinka caadiga ah

● Neefta beenta ah, oo aan lahayn xadhig la xoojiyay

Marxaladaha muhiimka ah ee falcelinta PCR-ga waxaa ka mid ah: ① diyaarinta template nucleic acids, ② tayada iyo qaaska ah ee asaasiga ah, ③ tayada enzymes ④ xaaladaha wareegga PCR.Helitaanka sababta waa in sidoo kale la falanqeeyo oo la darso xiriirinta sare.

Templates: ① Qaabka qaabku waxa uu ka kooban yahay borotiinno kala duwan, ② templateka waxa uu ka kooban yahay Taq enzyme inhibitor, ③ borotiinka templateka lama tirtirin, gaar ahaan borotiinka kooxda ee koromosoomka.⑤ Deminer nucleic acid hoos u dhaca ma aha mid dhamaystiran.Marka tayada ensaymyada iyo kuwa asaasiga ahi ay wanaagsan yihiin, ma jiraan koox xoojinaysa, taas oo u badan tahay daawaynta dheefshiidka ee shaybaarrada.Waxaa jira wax ka qaldan habka soo saarista nukleic acid template, si loo diyaariyo xal dheefshiidka oo waxtar leh oo deggan, nidaamkeeda waa in la hagaajiyaa oo aan si ikhtiyaari ah loo beddelin.

Insaymis la'aanta: ensaymes cusub ama labadaba duug iyo cusub waa in si wada jir ah loo isticmaalo si loo falanqeeyo in dhaqdhaqaaqa enzymku lumay ama ku filnayn, taasoo horseedaysa diidmo been ah.Waa in la ogaadaa in Taq enzyme ama ethidium bromide mararka qaarkood la iloobo.

Fure: tayada qoraxda, xooga saarista furaha, iyo in xooga saarida labada asal-is-simemetrical.Waa sababta caadiga ah ee fashilka PCR ama kooxda sii kordheysa maaha mid ku habboon oo u nugul inay faafiso.Waxaa jira dhibaatooyin xagga tayada aasaasayaasha nambarada dufcada qaarkood.Labada asaasiga ah waxay leeyihiin feejignaan sare iyo feejignaan hoose, taasoo keenaysa waxtarka hooseeya ee asymmetric.Tallaabooyinka ka-hortagga waa: ① Dooro furaha wanaagsan si aad u abuurto unugyo.② Diiradda asaasiga ah kuma xirna oo kaliya qiimaha OD, laakiin sidoo kale waxay fiiro gaar ah u leedahay dareeraha asalka ah ee asalka ah si loo sameeyo agar sonkorta gel electrophoresis.Waa in uu jiraa aag xariijin ah, dhalaalkuna waa in uu ahaado mid joogto ah.Suunka, PCR waxaa laga yaabaa inuu ku guuldareysto wakhtigan, waana in lagu xalliyaa unugga synthesis primer.Haddi primer uu sareeyo, dhalaalku wuu hooseeyaa, xooga saaristiisuna waa in la miisaamaa marka la qaso.③ Furaha waa in la bixiyaa oo lagu kaydiyaa si aad u sarreeya si looga hortago qaboojin badan ama qaybo qaboojiye waqti-dheer oo talaajad ah, taas oo keeni doonta in fureeyaha uu xumaado oo hoos u dhaco.④ Naqshadaynta furaha ayaa ah mid aan macquul ahayn, sida dhererka furaha oo aan ku filnayn, iyo kooxdu waxa ay ka dhex samaysan tahay aasaasayaasha.

Mg2+fiirinta: Mg2+ion-fiirsashada waxay saameyn weyn ku leedahay waxtarka xoojinta PCR.Xooga saarista xad-dhaafka ah waxay yarayn kartaa jinsiga ka soo horjeeda ee kordhinta PCR.Haddii xooga saaridu aad u hooseyso, wax soo saarka PCR-ga kor u qaadida ayaa xitaa ka dhigi doonta kor u qaadida PCR iyada oo aan la helin band balaarineed.

Beddelka mugga falcelinta: Mugga loo isticmaalo kor-u-qaadista PCR waa 20ul, 30ul, iyo 50ul ama 100uL, mugga weyn ee codsiga kordhinta PCR ayaa loo dejiyay iyadoo loo eegayo ujeedooyinka kala duwan ee cilmi-baarista sayniska iyo baaritaanka bukaan-socodka.Ka dib marka la sameeyo qiyaaso yaryar sida 20ul, waa lagama maarmaan in la sameeyo xaalad xadhig ah marka la samaynayo cabbirka, haddii kale way dhici doontaa.

Sababaha jireed: Isbeddelku aad buu muhiim ugu yahay kordhinta PCR.Haddii heerkulka hoos u dhaco uu hooseeyo, wakhtiga dhimashadu waa gaaban yahay, waxay u badan tahay inay ku dhacdo diidmo been ah;Heerkulka aadka u hooseeya wuxuu sababi karaa cod-weyneyn aan gaar ahayn wuxuuna yarayn karaa waxtarka cod-weyneysiinta gaarka ah.Si aad ah u saameeya isku dhafka aasaasiga ah iyo qaab-dhismeedka si loo yareeyo waxtarka kor u qaadida PCR.Mararka qaarkood waxaa lagama maarmaan ah in la isticmaalo heerkulbeegyada caadiga ah si loo ogaado kala duwanaanshiyaha, nuugista iyo heerkulka dheeraadka ah ee kordhinta ama kariyaha biyaha -soluble, taas oo ah mid ka mid ah sababaha fashilka PCR.

Kala duwanaanshaha isku xigxiga yoolka: Haddii taxanaha bartilmaameedku dhaco, beddelaad ama tirtirid, isku darka tusaalaha iyo qaab-dhismeedka ayaa la isku daraa, ama la'aanta isku xigxiga bartilmaameedka awgeed, furaha iyo qaab-dhismeedka ayaa lumin doona isku xigxiga dhammaystirka ah, iyo kor-u-qaadistiisa PCR ma noqon doonto mid guulaysata.

● Been wanaagsan

Kooxda PCR-ga ee kor u qaadida waxay u muuqataa mid la jaan qaadaya guutada taxanaha ah ee la beegsanayo, marmarka qaarkoodna guutadeedu aad bay u nadiifsan tahay oo ka saraysaa.

Naqshadaynta aasaasiga ah maaha mid ku habboon: taxanaha cod-weyneysiinta ee la doortay iyo kuwa aan ujeeddo-weyneynba waxay leeyihiin isku-dhafan, marka marka PCR-ga la kordhiyo, alaabooyinka PCR ee la xoojiyay waa taxane aan ujeeddo lahayn.Taxanaha bartilmaameedku aad buu u gaaban yahay ama asal-raacu aad buu u gaaban yahay, waxayna u nugul tahay wanaagga beenta ah.Waxa loo baahan yahay in dib loo habeeyo

Wasakhowga isdhaafka ah ee taxanaha bartilmaameedka ama alaabada kordhinta: Waxaa jira laba sababood oo wasakhowgan ah: Marka hore, wasakhowga isdhaafka ah ee dhammaan genome-ga ama qaybaha waaweyn, taasoo horseedaysa wanaag been abuur ah.Noocan been abuurka ah waxaa lagu xalin karaa hababka soo socda: Taxaddar oo tartiib ah inta lagu jiro hawlgalka si aad uga hortagto taxanaha bartilmaameedka in lagu neefsado qoriga muunada ama ka soo firdhiso tuubada centrifugal.Marka laga reebo enzymes-ka iyo walxaha aan u adkeysan karin heerkulka sare, dhammaan reagen-yada ama qalabka waa in lagu jeermis dilaha cadaadis sare.Tuubooyinka centrifugal iyo shaybaarrada waa in hal mar la isticmaalo.Marka loo baahdo, ka hor inta aan lagu darin muunado, tuubada falcelinta iyo reagent waxay la kulmaan fallaadhaha ultraviolet si ay u burburiyaan nucleic acid ee jira.Marka labaad, jajab yar oo wasakhowga hawada ah.Jajabyadan yar yar way ka gaaban yihiin isku xigxiga la beegsanayo, laakiin waxay leeyihiin wax isku mid ah.Waa la isku kala qaybin karaa.Ka dib marka la dhamaystiro aasaasayaasha, alaabta PCR waa la ballaarin karaa, taas oo keeni doonta wax soo saar been ah.Waxaa loo isticmaali karaa in lagu dhimo ama la baabi'iyo habka PCR buulka.

● U muuqato band-weyneyn aan gaar ahayn

Qaybaha soo muuqday ka dib kordhinta PCR waa kuwo aan ku habboonayn cabbirka la filayo, ama weyn ama yar, ama isku mar, ama waqti isku mid ah, xargaha cod-weyneysiinta gaarka ah iyo xargaha cod-weyneysiinta aan gaar ahayn.Soo ifbaxa xadhkaha aan gaarka ahayn waa: Marka hore, furayaashu waa kuwo aan dhammaystirnayn oo kaabaya isku xigxiga bartilmaameedka, ama polymerization of primer si loo sameeyo koox-kooxeed.Midda labaad waa in xoogga MG2+ ions uu aad u sarreeyo, heerkulka xajintu aad ayuu u hooseeyaa, tirada wareegyada PCR-ga ayaa xiriir la leh.Marka labaad, tayada iyo qadarka enzymes.Badanaa, ensaymes-yada ilaha qaarkood waxay u nugul yihiin kooxo aan gaar ahayn iyo enzymes-ka isha kale ma dhicin.Mararka qaarkood kor u qaadis aan gaar ahayn ee enzymes ayaa sidoo kale dhacda.Tallaabooyinka ka-hortagga waa: dib-u-qaabayn soo jiidasho leh haddii loo baahdo.Iska yaree xadiga insaymiska ama beddel enzyme-ka il kale.Iska yaree qaddarka aasaasiga ah, kordhi tirada jaantusyada si habboon, oo yaree tirada wareegyada.Si sax ah u kordhi heerkulka jilcinta ama isticmaal labada hab dhibic heerkul ah (93°C xumaanshaha, nuugista iyo fidinta qiyaastii 65°C).

● U muuqda jiid jiid jilicsan ama cajalad xoqin

Kordhinta PCR mararka qaarkood waxay u muuqataa in la mariyo ama qolof la saaray ama suunka rooga u eg.Sababtan awgeed, sababtoo ah qadarka xad-dhaafka ah ee enzymes ama tayada liidata ee enzyme-ka, xoojinta dNTP aad ayuu u sarreeyaa, xoojinta Mg2+ waa mid aad u sarreeya, heerkulka annealing ayaa aad u hooseeya, tirada wareegyada ayaa aad u badan.Tallaabooyinka ka-hortagga waa: ①Yaree tirada enzymes-ka, ama beddel enzyme-ka il kale.②Yaree fiirsashada dNTP ③Si sax ah u yaree feejignaanta Mg2+.④ Kordhi tirada jaantusyada oo yaree tirada wareegyada.

Alaabooyinka La Xiriira

Halyeyga PCR (oo leh Dye)

◮ Aaminnimada sare: 6 jeer ka badan enzyme Taq caadiga ah;

◮ Xawaaraha weyneynta

◮ Laqabsiga template oo badan

◮ Hufnaanta sare-u-qaadista

◮ Dulqaadka deegaanku wuu ka xoog badan yahay: waxaa lagu meeleeyaa 37°C toddobaad, isagoo ilaalinaya in ka badan 90% dhaqdhaqaaqa;

◮ Waxay leedahay 5'→3' dhaqdhaqaaqa DNA polymerase iyo 5'→3' dhaqdhaqaaqa exonuclease, iyada oo aan lahayn 3'→5' firfircoonida exonuclease.

PCR Easyᵀᴹ (oo leh Dye)

Nidaamka falcelinta gaarka ah iyo waxtarka sare ee Taq DNA Polymerase ayaa ka dhigaya fal-celinta PCR inay yeelato hufnaan sare-u-qaadis, gaar ahaan iyo dareen.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Hal Talaabo) -SYBR Cagaaran I

Xirmada hal-talaabo ah waxay samaysaa qoraalo rogan iyo qPCR laba falcelin oo isku mid ah tubbada, kaliya waxay u baahan yihiin in lagu daro template RNA, asal PCR gaar ah iyo RNase-free ddH₂O.

◮ Xirmadu waxay si degdeg ah oo hufan u falanqayn kartaa RNA fayraska ama raad RNA ah.

◮ Xirmadu waxay isticmaashaa reagent transcription u gaar ah Foregene iyo Foregene HotStar Taq DNA Polymerase oo ay weheliso nidaam falcelin gaar ah si ay si wax ku ool ah u wanaajiso waxtarka xoojinta iyo gaar ahaaneed ee falcelinta.

◮ Habka falcelinta ee la wanaajiyey ayaa ka dhigaysa fal-celintu inay yeelato dareenka ogaanshaha sare, xasilloonida kulaylka oo xooggan, iyo dulqaad wanaagsan.

◮ RT-qPCR Easy^TM(Hal Tallaabo) -SYBR Cagaaran I xirmada waxay la socotaa ROX dheeha tixraaca gudaha, kaas oo loo isticmaali karo in lagu baabi'iyo asalka calaamadaha iyo khaladaadka u dhexeeya ceelasha, taas oo ku habboon macaamiisha inay u isticmaalaan noocyo kala duwan oo qalab PCR ah.

RT Fudud^TMII (Master Premix oo loogu talagalay xarafka koowaad ee cDNA synthesis eeWaqtiga dhabta ah PCR)

-Awood waxtar leh oo looga saarayo gDNA, taas oo ka saari karta gDNA qaab-dhismeedka 2 daqiiqo gudahood.

-Nidaamka dib-u-dejinta oo hufan, waxay qaadataa 15 daqiiqo oo keliya in la dhammaystiro isku-darka cDNA-ga ugu horreeya.

Hababka isku dhafan: qaab-dhismeedka ka kooban GC-ga sare iyo qaab-dhismeedka sare ee adag ayaa sidoo kale lagu beddeli karaa hufnaan sare.

-Nidaamka qoraalka dib u celinta dareenka sare, jaantusyada heerka pg sidoo kale waxay heli karaan cDNA tayo sare leh.

-Nidaamka qoraalka dib u celinta ayaa leh xasillooni kulayl sare leh, heerkulka falcelinta ugu fiican waa 42 ℃, walina waxay leedahay wax qabad wanaagsan oo qoraal ah 50 ℃.