Tijaabada RT-qPCR waxaa ka mid ah soo saarista RNA iyo qiimeynta tayada, dib u qorida qoraalka iyo qPCR saddex tillaabo, tillaabo kastaa waxay leedahay taxadar badan, si faahfaahsan ayaan hoos ugu soo bandhigi doonaa.

ⅠQiimaynta tayada RNA

Tijaabada RT-qPCR, ka dib marka la dhammeeyo soo saarista RNA, tayada RNA waxay u baahan tahay in la qiimeeyo, tijaabada dabagalka waxa la samayn karaa oo kaliya ka dib marka ay u qalanto.Hababka qiimeynta waxaa ka mid ah spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 falanqaynta, oo ay ka mid yihiin spectrophotometer inta badan la isticmaalo iyo agarose gel electrophoresis habka ogaanshaha.Waa in la ogaadaa in labadan hab loo baahan yahay in si wadajir ah loo isticmaalo si loo dhamaystiro ogaanshaha iyo falanqaynta fiirsashada RNA, nadiifnimada iyo daacadnimada, si loo hubiyo tayada RNA.

Xirmada Go'doonka RNA ee laxidhiidha: 

Qalabka Go'doominta unugga ee RNA

Wadarta guud ee RNA oo si aad ah loo sifeeyay oo tayo sare leh ayaa laga heli karaa unugyo dhaqan oo kala duwan 11min gudaheed.

Wadarta Xayawaanka Qalabka Go'doonka RNA

Si degdeg ah oo hufan uga soo saar wadarta guud ee RNA nadiif-sare iyo tayo sare leh oo laga soo saaray unugyo xayawaanno kala duwan.

Spectrophotometer:

spectrophotometer-ka waxaa inta badan loo isticmaalaa si loo go'aamiyo diiradda iyo daahirsanaanta RNA, laakiin ma ogaan karto daacadnimada RNA iyo hadhaaga genomic.Waxaa ka mid ah, A260/280 iyo A260/230 waa halbeegyo muhiim u ah ogaanshaha nadiifnimada RNA, iyo daahirnimada RNA waxaa lagu ogaan karaa iyadoo loo eegayo isbedbeddelka qiyamkooda:

1.9.A260/280 <1.9, taas oo muujinaysa in laga yaabo in ay jiraan hadhaaga borotiinka ee RNA;A260 / 280> 2.1, taas oo muujinaysa hoos u dhaca qayb ka mid ah RNA, taas oo lagu sii xaqiijin karo by agarose gel electrophoresis.

2.0.A260/230 <2.0, taasoo muujinaysa inay jiri karaan hadhaagii reagents organic ee RNA, sida phenols, ethanol ama sonkor.

Agarose gel electrophoresis:

Agarose gel electrophoresis assay waxay falanqayn kartaa daacadnimada RNA, genome iyo hadhaaga borotiinka, laakiin si sax ah uma qiyaasi karto xoogga RNA ama ma ogaan karto hadhaaga reagents organic.Qaado tusaalaha eukaryotic RNA templates:

1. RNA waxa lagu sakhiray agarose gel electrophoresis.Haddii ay jiraan kaliya saddex xabbo oo kaliya oo ah 28sRNA, 18sRNA iyo 5.8sRNA ee khariidadda jel, waxay muujinaysaa in RNA-ga la soo saaray uu yahay mid sugan.Haddii ay jirto ifafaale soo jiidasho leh, waxay muujinaysaa qayb hoos u dhac ku yimid RNA.

2. Haddii ay jirto hal band oo dhalaalaya oo u dhexeeya daloolka xabagta iyo 28sRNA band, waxaa jiri kara haraaga DNA-ga.

3. Haddii xargaha ay ka muuqdaan daloolka xabagta, waxay muujinaysaa inay jiri karaan hadhaagii borotiinka iyo walxaha kale ee makromolecular.

Ⅱ. Dib u qorista

Ka dib markii soo saarista RNA la dhammeeyo, waxay u baahan tahay in loo rogo cDNA tijaabooyinka xiga, markaa talaabada rogaal celisku waa lama huraan.Qoraalka qoraalka ah ayaa laga soo saari doonaa xulashada qoraalka qoraalka ah iyo asalka:

Dib u eegista qoraalka qoraalka:

Qoraallada caadiga ah ee qoraalka ah waxaa ka mid ah AMV RTase iyo MMLV RTase.RNase H ee AMV RTase waxay leedahay firfircooni xoog leh, dhererka ereyada gaaban, qadar yar oo isku dhafan iyo xasilloonida kulaylka wanaagsan (42 ~ 55 ℃).Dhaqdhaqaaqa RNase H ee MMLV RTase waa daciif, dhererka isugeynta ayaa dheer, qadarka isku-darka ayaa sarreeya, xasiloonida kulaylkuna waa liidata (37 ~ 42 ℃).

Sababtoo ah enzyme RNase H wuxuu leeyahay shaqada hoos u dhigista qaabka RNA, MMLV oo leh dhaqdhaqaaqa daciifka ah ee RNase H waa in si gaar ah loo doortaa inta lagu guda jiro qoraalka dib u dhigista, iyo ka dib injineernimada hidde-wadaha, xasiloonida kulaylka ee MMLV waxay gaartay heer sare oo tayo leh.Qaadashada ForegeneTranscriptase Reverse Reverse(M-MLV oo loogu talagalay qoraal-qorista gadaal) Tusaale ahaan, waa transcriptase cusub oo gadaal ka ah oo lagu muujiyey bakteeriyada E. coli injineernimada iyadoo la adeegsanayo tignoolajiyada dib-u-habaynta hidda-socodka.Waa polymerase DNA-ga dib-u-habayn ah oo isku-dhafan DNA-ga kaabaya RNA, DNA, ama RNA: DNA hybrid.Ma laha wax qabad RNase H, xasillooni xoog leh, xidhiidh RNA xoog leh, iyo dareen ogaansho sare leh.

 

Transcriptase Reverse Reverse(M-MLV oo loogu talagalay qoraal-qorista gadaal)

Xulashada asaasiga ah:

Guud ahaan aas-aasayaasha RT waxay u kala baxaan saddex qaybood: oligo dT, primers random, iyo kuwa hidde-sidaha u gaarka ah.Dooro furayaasha ku habboon isticmaalka iyadoo loo eegayo shuruudaha tijaabada ee kala duwan.

1. Haddii qaabku yahay asal eukaryotic ah oo cDNA-da dambe loo istcimaalo kordhinta PCR ee joogtada ah, Oligo (dT) ayaa lagula talinayaa;Haddii tijaabada xigta loo isticmaalo qPCR kaliya, Oligo (dT) waxaa lagu talinayaa in lagu qaso furayaasha randomka si loo hagaajiyo waxtarka qoraalka gadaasha.

2. Haddii templateku ka yimaaddo prokaryotes, Random Primers ama hidde-sideyaal u gaar ah waa in loo doortaa qoraalka kale.

Ⅲ.qPCR

Qiyaasta Fluorescence waxaa inta badan lagu faahfaahiyay xulashada hababka tirada, mabaadi'da naqshadaynta asaasiga ah, xulashada ROX, habaynta nidaamka falcelinta iyo dejinta xaaladaha falcelinta, iwm.

Xulashada hababka tirada:

Hababka tiro-koobka waxa loo qaybiyaa habab qiyaaseed qaraabo ah iyo habab qiyaaseed oo dhammaystiran.Qiyaasta qaraabada ah waxaa loo isticmaali karaa in lagu ogaado saameynta hababka daawaynta qaarkood ee muujinta hidda-wadaha, la ogaado kala duwanaanshaha muujinta hidda-wadaha waqtiyo kala duwan iyo isbarbardhigga farqiga muujinta hiddaha ee unugyo kala duwan.Tiro dhammaystiran waxay ogaan kartaa qaddarka nukleic acid ee fayraska iyo wixii la mid ah.Marka la samaynayo tijaabooyinka, waa in aan doorano hababka qiyaaseed ee ku haboon sida ay qabaan tijaabooyinkeena gaarka ah.

Mabaadi'da naqshadaynta aasaasiga ah:

Naqshadeynta asaasiga ah ee qPCR waxay si toos ah ula xiriirtaa hufnaanta iyo wax soo saarka gaar ahaaneed.Sidaa darteed, si sax ah u naqshadaynta aasaasayaasha wanaagsan waa tallaabada ugu horreysa ee qPCR ee lagu guuleysto.Naqshadeynta asaasiga ah, mabaadi'da soo socota waa in fiiro gaar ah loo yeesho marka la kulmayo mabda'a naqshadeynta asaasiga ah:

1. Dhererka jajabka bartilmaameedka waxaa lagu xakameynayaa inta u dhaxaysa 100 iyo 300 bp;

2. Naqshad ka gudubta-exon si looga fogaado saameynta DNA-da genomic;

3. Qurxinta nashqada leh waxay u baahan yihiin in lagu tijaabiyo hufnaanta cod-weyneysiinta, oo kaliya marka waxtarka cod-weyneyntu gaadho heerka (90-110%) ayaa loo isticmaali karaa tijaabooyin tiro;

4. Diiradda koowaad waxaa badanaa lagu hagaajiyaa inta u dhaxaysa 0.1uM iyo 1.0uM.

XulashadaROX:

Habka falcelinta tirada, ROX waxay hagaajin kartaa faraqa u dhexeeya jidka indhaha, qaladka tuubada ama farqiga mugga ee ay keento uumiga iyo uumi si isku mid ah, hagaajinta ku celcelinta natiijooyinka.Si kastaba ha ahaatee, waa in la ogaadaa in xulashada ROX ay la xiriirto qalabka.Haddii qalabka qPCR uu leeyahay shaqada ah inuu si toos ah u saxo farqiga u dhexeeya godadka, uma baahna inuu ku daro ROX;Haddii kale, waxay u baahan tahay inay ku darto sixitaanka ROX.Wada-hawlgalayaasha yaryar ee iibsada reagents waa inay ahaadaan si waafaqsan qalabka loo isticmaalo in lagu doorto ROX saxda ah, iska ilaali khaladaadka dambe.

Diyaarinta habka falcelinta:

Mugga falcelinta ee 20ul iyo 50ul ayaa la door bidaa.Arrimaha soo socda waa in fiiro gaar ah loo yeesho marka nidaamka la dejinayo:

1. Nidaamka falcelinta wuxuu u baahan yahay in lagu diyaariyo hawo ku jirta kursiga shaqada ee aadka u nadiifka ah, ddH cusub₂O waxa loo isticmaalaa tijaabo kasta;

2. Tijaabo kastaa waxay u baahan tahay inay diyaariso NTC si ay u xaqiijiso inay wasakh ku jirto nidaamka, iyo in lamaane kasta oo aasaasi ah ay u baahan yihiin inay sameeyaan NTC marka la diyaarinayo nidaamka;

3. Si loo ogaado in ay jirto hadhaaga gDNA ee qaabka RNA, NRT waxa loo diyaarin karaa muunad kasta si loo ogaado;

4. Marka la diyaarinayo nidaamka, waxaa lagu talinayaa in la sameeyo ugu yaraan 3 farsamo soo noqnoqda hal muunad;

5. Marka template uu yahay cDNA, waxaa lagu talinayaa in la milo 5-10 jeer si loo yareeyo saamaynta ka-hortagga ah ee nidaamka qorista ee tijaabada qPCR.Way fiicantahay in lagu sahamiyo tirada templateka iyadoo loo eegayo gradient, si qiimaha CT uu u dhaco inta u dhaxaysa 20-30;

6. Go'aami tirada loo baahan yahay ee falcelinta, kordhi 5-10% iyadoo lagu saleynayo tirada falcelinta, oo xisaabi lambarka qaabeynta mugga;

7, nidaamka waxaa loo diyaariyey iyadoo la isticmaalayo mabda'a premix, isku darka ka dib centrifugation iyo in la hubiyo in aan goobooyin;

8, Inta suurtogalka ah si aad u doorato agabka taageerada.

Qalabka RT-qPCR ee la xidhiidha