Gaar ahaan ogaanshaha

Xaaladaha intooda badan, ujeedada naqshadaynta asaasiga ahi waa in la kordhiyo gaar ahaaneed ee PCR.Tan waxaa lagu go'aamiyaa in badan ama ka yar saameynta la saadaalin karo ee doorsoomayaal badan.Mid ka mid ah doorsoomayaasha muhiimka ah waa isku xigxiga 3′dhammaadka furaha.

Muhiimad ahaan, qiimeynta PCR ee loogu talagalay gaar ahaan waxay u badan tahay inay sii wadaan waxtarka sare ee baaxad weyn oo firfircoon, sababtoo ah shaybaarku ma soo saaro alaab-weyneyn aan gaar ahayn, taas oo la tartameysa PCR reagents ama xannibaya falcelinta weyneynta.

Dabcan, xaaladaha qaarkood, gaar ahaan ma aha tan ugu muhiimsan, tusaale ahaan, marka ujeedadu tahay in la qiyaaso si dhow loola xiriiro laakiin cudur-sidaha kala duwan, naqshad gaar ah, hagaajinta iyo heerarka xaqiijinta ayaa loo baahan yahay.

Qalooca dhalaalka ah waa hab caadi ah oo lagu qiimeeyo gaar ahaan amplicon-yada, ugu yaraan marka la eego in la kordhiyo hal bartilmaameed.Si kastaba ha ahaatee, waa in la caddeeyo in qalooca dhalaalidda ay noqon karaan marin habaabin sababtoo ah, tusaale ahaan, waxay saameyn karaan saameynta isku dhafan ee asaasiga hoose ee hoose iyo uruurinta template hoose.

P5 |Qalooca dhalaalku wuxuu muujinayaa isbeddelada Tm ee laga helay laba cadad oo kala duwan oo ah laba DNA oo bartilmaameed ah.

A. Heerarka sare ee xayaysiiska), ma jiro dimer cad oo cad ka dib cabirka qPCR la dhammeeyo.Marka fiirsiga qaab-dhismeedka uu hoos ugu dhaco 50 nuqul (e), badeeco aan gaar ahayn ayaa bilaaba inay soo baxdo oo waxay noqotaa badeecada kaliya ee ugu hoosaysa (f).

B. Tijaabadu waxay diiwaangelisay isla Tms dhammaan bartilmaameedyada bartilmaameedka ah, mana jirin dimer cad oo cad xittaa fiirsiga ugu hooseeya (5 nuqul).Markaad isticmaalayso labadan hab ee lagu ogaanayo, wax alaab kordhin ah laguma helin NTC-yada.

P5 waxay tusinaysaa qaloocyada kala dirida ee lagu helay muunado kuwaas oo qaab-dhismeedka uu ku jiro xaddi kala duwan.P 5a waxay muujinaysaa in labada xajmi ee ugu hooseeya, Tms ee alaabada kordhinta aan gaarka ahayn ee la soo saaro ay ka hooseeyaan kuwa amplicon-yada gaarka ah.

Sida iska cad, habkan ogaanshaha si dhab ah looma isticmaali karo si loo ogaado bartilmaameedyada ka jira xaddi hoose.

Waxa xiiso leh, NTC-yada, ie, muunado aan lahayn DNA gabi ahaanba, ma diiwaangelin (aan gaar ahayn) alaab-weyneyn, taasoo muujinaysa in DNA-ga asalka ah uu ka qaybqaadan karo cod-weyneyn/polymerization aan gaar ahayn.

Mararka qaarkood aasaasayaasha asalka ah iyo kor u qaadis aan gaar ahayn lama hagaajin karo, laakiin inta badan waa suurtogal in la naqshadeeyo hab lagu ogaanayo oo aan lahayn kor u qaadis aan gaar ahayn oo ku saabsan fiirsashada template kasta iyo NTC (P 5b).

Halkan, xitaa duubista xoojinta diirada bartilmaameedka Cq ee 35 waxay soo saari doontaa qalooc gaar ah.Sidoo kale, NTC-yadu ma muujin calaamado kordhin aan gaar ahayn.Mararka qaarkood, hab-dhaqanka ogaanshaha waxa laga yaabaa inuu ku xidhan yahay khamriga hooyada, oo kaliya kordhinta aan gaarka ahayn ayaa lagu ogaadaa qaybo kayd ah oo gaar ah, kuwaas oo laga yaabo inay la xidhiidhaan kala duwanaansho Mg2+ ah.

Xasiloonida ogaanshaha

Hagaajinta Ta waa tallaabo faa'iido leh oo ku aaddan xaqiijinta la taaban karo iyo habka wanaajinta ee ogaanshaha qPCR.Waxay si toos ah u bixinaysaa tilmaanta adkeysiga asaasiga ah ee la dejiyay iyadoo tuseysa heerkulka (ama kala duwanaanta heerkulka) ee soo saara Cq ugu hooseeya iyada oo aan la kordhin NTC.

Labada ilaa afar-laab ee kala duwanaanshaha dareenka ayaa laga yaabaa inaysan muhiim u ahayn dadka leh muujinta mRNA sare, laakiin tijaabooyinka ogaanshaha, waxay la macno noqon kartaa farqiga u dhexeeya natiijooyinka taban ee togan iyo beenta ah.

Sifooyinka Ta ee aasaasayaasha qPCR aad ayey u kala duwanaan karaan.Tijaabooyinka qaarkood aad uma xoog badna, haddii aan lagu samaynin qiimaha ugu fiican ee Ta ee furayaasha, si dhakhso ah ayay u dumayaan.

Tani waa muhiim sababtoo ah ogaanshaha noocan oo kale ah ayaa inta badan dhib ku ah aduunka dhabta ah, iyo nadiifnimada muunada, xoojinta DNA, ama joogitaanka DNA kale ayaa laga yaabaa inaanay fiicnayn.

Intaa waxaa dheer, nambarka nuqulka bartilmaameedku wuxuu ku kala duwanaan karaa kala duwanaansho ballaaran, iyo reagents, maacuunta balaastigga ah, ama qalabka ayaa laga yaabaa inay ka duwan yihiin kuwa loo isticmaalo marka la dejinayo imtixaanka.

P6| Heerkulka heerkulku wuxuu muujinayaa adkaanta kala duwan ee ogaanshaha PCR.

A. Adeegso Bioline's Sensifast SYBR mastermix (lambarka buugga BIO-98050) si aad PCR ugu sameyso cDNA oo laga diyaariyey maskaxda aadanaha RNA.

B. Isticmaal qalabka Bio-Rad ee CFX qPCR si aad u duubto khariidadda cod-weyneysiinta iyo qalooca apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGTGATCTCCTAGG).

C. garaafka weynaynta iyo qalooca dhalaalka ee ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACCTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGCTCTGACTCAG).

D. garaafka weynaynta iyo qalooca kala dirida ee GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGATCTTC).

E. Cqs ayaa lagu duubay heerkul kala duwan, taas oo muujinaysa farqiga u dhexeeya Cq ee lagu diiwaan geliyay heerkulkiisu yahay 7C.

P 6 waxay tusinaysaa natiijada caadiga ah ee tijaabada aan loo baahnayn, halkaasoo qPCR lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo gradient Tas inta u dhaxaysa 59C iyo 67C (P 6a), iyada oo la adeegsanayo aasaasayaasha saddex hidde-siyeedka maskaxda aadanaha.

Waxaa laga arki karaa garaafka cod-weyneysiinta in Opalin primers ay aad uga fog yihiin heerka ugu sarreeya sababtoo ah kala duwanaanshahooda ugu fiican Ta waa mid aad u cidhiidhi ah (Jaantuska 6b), taas oo ah, Cqs si ballaaran ayaa loo kala firdhiyey, taasoo keentay in Cqs si weyn loo barbar dhigo Cqs hoose ee ugu fiican.

Habkan ogaanshaha waa mid aan degganayn waxaana laga yaabaa inuu u horseedo kor u qaadis heersare ah.Sidaa darteed, lamaanahan asaasiga ah waa in dib loo habeeyaa.Intaa waxaa dheer, falanqaynta qalooca dhalaalidda (inset) waxay muujinaysaa in habka gaarka ah ee habkan lagu ogaanayo uu sidoo kale noqon karo dhibaato, sababtoo ah qalooca dhalaalka ee Ta kasta waa ka duwan yahay.

Habka ogaanshaha ACSBG1 ee lagu muujiyey P 6c wuu ka xoog badan yahay habka ogaanshaha Opalin ee kor ku xusan, laakiin wali way ka fog tahay ku habboonaanta, waxayna u badan tahay in la hagaajin karo.

Si kastaba ha ahaatee, waxaan ku nuuxnuuxsanaynaa in aysan jirin xiriir lagama maarmaan ah oo u dhexeeya adkeynta iyo gaar ahaaneed, sababtoo ah qalooca kala dirida ee ay soo saartay habkan ogaanshaha ayaa muujinaya qiimaha ugu sarreeya ee dhammaan Tas (ku-darida).

Dhanka kale, imtixaanka adkeysigu aad buu u dulqaadan karaa, isaga oo soo saaraya Cqs la mid ah tiro balaadhan oo Tas ah, sida imtixaanka GFAP ee lagu muujiyay P 6d.

Farqiga u dhexeeya Cqs ee lagu helay isla 8 darajo Celsius waa ka yar yahay 1, iyo qalooca kala dirida (kumbuyuutarku) wuxuu xaqiijinayaa sifooyinka lagu ogaanayo heerka heerkulkan.Waxaa xusid mudan in Tas-ka la xisaabiyay iyo tirada dhabta ah ee Ta ay aad uga duwanaan karaan.

Waxaa jira tilmaamo badan oo loogu talagalay in lagu caawiyo cilmi-baarayaasha inay qaabeeyaan aasaasiyaal hufan, kuwaas oo intooda badan ay ku saleysan yihiin xeerar muddo dheer la soo dhisay oo fiiro gaar ah la siiyay 3′dhamaadka aasaasiga ah.Inta badan waxa lagu taliyaa in lagu daro G ama C xagga 3'da danbe iyo laba saldhig oo G ama C (xajinta GC), laakiin aan ka badnayn laba ka mid ah 5ta saldhig ee ugu dambeeya.

Ficil ahaan, xeerarkani waxay hagi karaan cilmi-baarayaasha, laakiin maahan kuwo sax ah xaalad kasta.

P7 |Dhamaadka 3'aad ee asaasiga ah ayaa saameyn yar ku leh gaarnimada ama hufnaanta.

A. Meesha asaasiga ah ee hiddo-wadaha HIF-1a (NM_181054.2).

B. Isticmaal Agilent Brilliant III SYBR khamriga hooyada Cagaaran (Bisad No. 600882) si aad u kordhiso lix shay oo tijaabo ah.

C. garaafka kordhinta iyo qalooca dhalaalka ee uu duubay Bio-Rad's CFX qPCR qalab iyo 3'dhamaadka aasaasiga ah.NTC-yada waxaa lagu muujiyay casaan

D. Cqs diiwaanka shay kasta oo imtixaan ah

Tusaale ahaan, natiijada P 7 waxay ka hor imanaysaa xeerka 3′aad.Dhammaan nashqadaha waxay soo saaraan asal ahaan natiijooyin isku mid ah, oo leh laba kaliya oo isku-dar ah oo asal ah oo horseedaya kor u qaadis aan gaar ahayn oo NTC ah.

Si kastaba ha ahaatee, ma taageeri karno saamaynta GC clip-ka, sababtoo ah kiiskan, isticmaalka A ama T ugu badnaan 30 saldhig ma yaraynayso gaar ahaaneed.

Tijaabada C, halkaas oo F primer-ku ku dhamaado GGCC, ayaa ku duubay Cqs ee NTC-yada, taas oo muujinaysa in mid laga yaabo inuu rabo inuu ka fogaado taxanahan 30-dhamaadka.Waxaan ku nuuxnuuxsanaynaa in sida kaliya ee lagu go'aamin karo isku xigxiga 3'dhamaadka ugu wanaagsan ee lammaanaha aasaasiga ah ay tahay in la qiimeeyo qaar ka mid ah musharraxiinta si tijaabo ah.

Hufnaanta kordhinta

Muhiimad ahaan, in kasta oo ogaanshaha PCR ee aan khaaska ahayn waligiis noqon karin mid gaar ah, waxtarka kordhinta waa la hagaajin karaa waxaana lagu kordhin karaa siyaabo badan oo kala duwan iyadoo la beddelayo enzyme, khamriga hooyada, waxyaabaha lagu daro, iyo xaaladaha baaskiilka.

Si loo qiimeeyo waxtarka ogaanshaha PCR, waxaa ugu wanaagsan in la isticmaalo qasitaan taxane ah oo ah 10 ama 5 jeer bartilmaameedka nucleic acid, taas oo ah, "habka qalooca caadiga ah".

Haddii PCR amplicons ama bartilmaameedyada DNA-da synthetic loo isticmaalo si loo dhaliyo qalooca caadiga ah, isku-darka bartilmaameedyadan waa in lagu qaso cadad joogto ah oo DNA-da asalka ah (sida DNA-da genomic).

P8 |Qalooca qalooca si loo qiimeeyo waxtarka PCR.

A. U isticmaal aasaasayaasha HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA iyo R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC iyo Agilent's Brilliant III SYBR Mastermix (lambarka buugga 600882) ee PCR iyo xaaladaha qalooca dhalaalka.

B. 100 ng RNA waa la rogay, waa la qasi jiray 2 jeer, iyo muunado cDNA ah oo si taxane ah loo qasi jiray ayaa lagu qasi jiray 5 jeer ilaa 1 ng DNA-da aadanaha.Qalooca dhalaalka ayaa lagu muujiyay gudaha.

C. Dareen-celinta RT, milanka, iyo milanka taxanaha ah ayaa lagu soo celiyay muunadda cDNA ee labaad, natiijaduna waxay la mid tahay.

P 8 waxay muujinaysaa laba geesood oo caadi ah, iyadoo la adeegsanayo habka lagu ogaanayo laba nooc oo cDNA ah oo kala duwan, natiijadu waa isku mid waxtarka, oo ku saabsan 100%, iyo qiimaha R2 ayaa sidoo kale la mid ah, taas oo ah, heerka ku habboonaanta xogta tijaabada ah iyo xariiqda dib u celinta ama xogta Degree of linearity.

Labada qaloocood ee caadiga ahi waa is barbar dhig, laakiin isku mid maaha.Haddii ujeedadu tahay in si sax ah loo qiyaaso bartilmaameedka, waa in la ogaadaa in aan la aqbali karin in la bixiyo xisaabinta nambarka nuqul iyada oo aan la sharraxin hubaal la'aanta.

P9 |Hubanti la'aanta cabbirka ee la xiriirta tirinta iyadoo la adeegsanayo qalooca caadiga ah.

A. U isticmaal aasaasayaasha GAPDH (NM_002046) si aad u samayso PCR iyo xaaladaha qalooca dhalaalka.F: ACAGTTGCCATGTAGACC iyo R: TAACTGGTTGAGCACAGG iyo Bioline's Sensifast SYBR mastermix (lambarka buuga BIO-98050).

B. Shaxda kordhinta, qalooca dhalaalka iyo qalooca caadiga ah ee lagu duubay aaladda Bio-Rad ee CFX qPCR.

C. Jaantuska qalooca caadiga ah iyo 95% inta u dhaxaysa kalsoonida (CI).

D. Nambarka koobiga iyo 95% inta u dhaxaysa kalsoonida ee saddexda qiyam ee Cq ee ka soo jeeda qalooca qaska.

P 9 waxay tusinaysaa in imtixaan la hagaajiyay, kala duwanaanshiyaha asalka ah ee hal qalooca caadiga ah waa qiyaastii 2 jeer (95% inta u dhaxaysa kalsoonida, ugu yaraan ilaa ugu badnaan), taas oo noqon karta kala duwanaanshaha ugu yar ee la filan karo.

Alaabta la xidhiidha:

Qalabka tooska ah ee RT qPCR Kit

Qalabka PCR ee Mouse Tail Direct

Xirmada PCR-da tooska ah ee unugyada xoolaha