RT-qPCR waxaa laga soo saaray farsamada PCR ee caadiga ah.Waxay ku darsataa kiimikooyinka fluorescent (midabyada fluorescent ama shaybaarrada fluorescent) nidaamka falcelinta PCR ee dhaqameed, waxayna ogaanaysaa habsocodka PCR-daynta iyo kordhinta wakhtiga dhabta ah iyadoo loo eegayo hababka iftiinka kala duwan.Isbeddelka ishaarada fluorescent ee dhexdhexaadka ah ayaa loo isticmaalaa si loo xisaabiyo qaddarka isbeddelka badeecada wareeg kasta ee PCR.Hadda, hababka ugu caansan waa habka dheeha fluorescent iyo habka baaritaanka.

Habka dheeha fluorescent:
Qaar ka mid ah midabada fluorescent, sida SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, iwm, ma sii daayaan iftiin keligood, laakiin waxay sii daayaan fluorescence ka dib markay ku xidhmaan jeexdin yar ee dsDNA.Sidaa darteed, bilawga falcelinta PCR, mashiinku ma ogaan karo calaamadda fluorescent.Marka falcelintu u socoto sii-kordhinta-kordhinta (qaabka laba-tallaabo) ama marxaladda fidinta (habka saddex-tallaabo), xargaha laba-laaban ayaa la furay wakhtigan, iyo polymerase DNA-ga cusub Inta lagu jiro isku-dhafka strand, molecules fluorescent ayaa lagu daraa jeexdin yar oo dsDNA ah waxayna soo saaraan fluorescence.Marka tirada wareegyada PCR ay korodho, midabyo badan oo badan ayaa ku biiraya dsDNA, iyo calaamada fluorescent sidoo kale si joogto ah ayaa loo xoojiyaa.U soo qaado SYBR Green Ⅰ tusaale ahaan.
Habka baaritaanka:
Baaritaanka Taqman waa baaritaanka ugu badan ee la isticmaalo.Waxaa jira koox fluorescent ah oo ku taal 5′ dhamaadka baaritaanka, badanaa FAM.Baadhitaanka laftiisu waa taxane kaabaya hidda-sidaha la beegsaday.Waxa jira koox damaysa fluorescent oo ku taal 3′ dhamaadka fluorophore-ka.Marka loo eego mabda'a wareejinta tamarta resonance (Förster resonance energy transfer, FRET), marka weriyaha fluorescent kooxda (deeqaha fluorescent molecule) iyo kooxda fluorescent deminaya (aqbala fluorescent molecule). molecule, halka autofluorescence uu daciifo.Sidaa darteed, bilawga falcelinta PCR-ga, marka baaritaanku uu xor yahay oo uu ku jiro nidaamka, kooxda fluorescent weriyaha ma siidayn doonto fluorescence.Marka la tirtirayo, furaha iyo baaritaanka waxay ku xiran yihiin qaabka.Inta lagu jiro marxaladda fidinta, polymerase wuxuu si joogto ah u farsameeyaa silsilado cusub.polymerase DNA wuxuu leeyahay 5'-3' dhaqdhaqaaqa exonuclease.Marka la gaaro baaritaanka, polymerase-ka DNA-ga wuxuu biyo-baarijin doonaa baaritaanka qaab-dhismeedka, wuxuu ka sooci doonaa kooxda fluorescent weriyaha iyo kooxda fluorescent-ka, oo sii deyn doona calaamada fluorescent.Maadaama uu jiro xidhiidh mid-ka-mid ah oo u dhexeeya baaritaanka iyo qaab-dhismeedka, habka baaritaanka ayaa ka sarreeya habka dheeha marka loo eego saxnaanta iyo dareenka imtixaanka.

Jaantuska 1 Mabda'a qRT-PCR

Naqshadaynta asaasiga ah
Mabaadi'da:

Furayaasha waa in lagu nashqadeeyaa gobolka la xafiday ee taxanaha aashitada nukliyeerka oo ay leeyihiin gaar.

Way fiicantahay in la isticmaalo isku xigxiga cDNA, iyo isku xigxiga mRNA sidoo kale waa la aqbali karaa.Haddaysan ahayn, ogow nakhshadeynta gobolka cds ee taxanaha DNA-da.
Dhererka sheyga qiyaasta fluorescent waa 80-150bp, kan ugu dheer waa 300bp, dhererka asaasiga ah wuxuu guud ahaan u dhexeeyaa 17-25 saldhig, farqiga u dhexeeya korka iyo kuwa hoose waa inaysan noqon mid aad u weyn.

Waxa ku jira G+C waa inta u dhaxaysa 40% iyo 60%, iyo 45-55% waa tan ugu fiican.
Qiimaha TM wuxuu u dhexeeyaa 58-62 digrii.
Isku day inaad iska ilaaliso dimers-yada iyo is-dimers-ka, (ha u muuqan in ka badan 4-labo oo isku xigta oo saldhig ah) qaab dhismeedka timaha, haddii aan laga fursan karin, samee ΔG <4.5kJ/mol qaab dhismeedka joogtada ah (2-3) aasaasayaasha iyo kuwa aan ahayn
gaar ah Isku-darka isku xigxiga ee si kala duwan loo xoojiyey ayaa la door bidaa in ka yar 70% ama waxa uu leeyahay 8 homology-ga aasaasiga ah.
Database:
CottonFGD ku raadinta ereyada muhiimka ah
Naqshadaynta koowaad:
IDT-qPCR naqshadaynta aasaasiga ah

Fig2 IDT bogga aaladda naqshadaynta aasaasiga ah

Sawirka 3 bogga natiijada
Naqshadeynta aasaasiga ah ee lncRNA:
lncRNA:talaabooyin la mid ah sida mRNA.
miRNA:Mabda'a habka stem-loop: Maadaama dhammaan miRNA-yadu ay yihiin taxane gaagaaban oo ku saabsan 23 nt, ogaanshaha tooska ah ee PCR lama samayn karo, markaa qalabka isku xigxiga stem-loop ayaa la isticmaalaa.Isku xigxiga stem-loop waa DNA-ga hal-xidhaale ah oo qiyaastii ah 50 nt, kaas oo samayn kara qaab-dhismeedka timaha laftiisa.3 'Dhammaadka waxaa loo qaabayn karaa si isku xigxig ah oo kaabaya qayb ka mid ah miRNA, ka dibna bartilmaameedka miRNA waxaa lagu xiri karaa taxanaha stem-loop inta lagu gudajiro qoraalka gadaasha, iyo dhererka guud wuxuu gaari karaa 70bp, kaas oo la jaan qaadaya dhererka alaabta la xoojiyay ee ay go'aamisay qPCR.Tailing miRNA naqshadeynta aasaasiga ah.
Ogaanshaha gaarka ah ee xoojinaya:
Xogta qaraxa khadka tooska ah: Qaraxa CottonFGD ee isku xigxiga
Qarax maxalli ah: Tixraac isticmaalka Blast+ si aad u sameyso qaraxa maxalliga ah, linux iyo macos waxay si toos ah u dhisi karaan xog ururin maxalli ah, nidaamka win10 sidoo kale waa la samayn karaa ka dib marka la rakibo ubuntu bash.Abuur xogta qaraxa deegaanka iyo qaraxa deegaanka;fur ubuntu bash on win10 .
Ogeysiis: Cudbiga sare iyo suufka jasiiradda badda waa dalagyo tetraploid ah, markaa natiijada qaraxu waxay inta badan noqon doontaa laba ama in ka badan oo taramo.Waagii hore, isticmaalka NAU cds ahaan xog ururin si loo sameeyo qaraxa waxay u badan tahay in la helo laba hidde-sideyaal isku mid ah oo leh dhawr farqi oo SNP ah.Caadiyan, labada hiddo-wade ee isku midka ah laguma kala saari karo naqshadda asaasiga ah, sidaas darteed waxaa loola dhaqmaa si isku mid ah.Haddii ay jirto indel cad, furaha waxaa badanaa loogu talagalay indelka, laakiin tani waxay u horseedi kartaa qaabka labaad ee asaasiga ah Tamarta bilaashka ah waxay noqotaa mid sare, taasoo keenta hoos u dhaca waxtarka xoojinta, laakiin tani waa mid aan laga fursan karin.

Ogaanshaha qaabdhismeedka sare ee aasaasiga ah:
Talaabooyinka:furan oligo 7 → habraaca wax gelinta ee isku xigxiga → daaqad-hoosaad u dhow → keydso → raadi furaha template, riix ctrl+D si aad u dejiso dhererka asalkaNatiijadii hore ee hore waa mid wanaagsan, ma jirto qaab-dhismeed muuqda iyo timo-timo, ma jiraan saldhigyo dhammaystiran oo joogto ah, iyo qiimaha buuxda ee tamarta bilaashka ah waa wax ka yar 4.5, halka muraayadda dambe ay muujinayso si joogto ah 6-da saldhig ayaa ah kuwo dhammaystiran, iyo tamarta bilaashka ah waa 8.8;Intaa waxaa dheer, dimer aad halis u ah ayaa ka muuqda dhamaadka 3′, waxaana muuqda dimer 4 saldhig oo isku xigta.In kasta oo tamarta xorta ahi aanay sareyn, 3′ dimer Chl waxa ay si dhab ah u saamayn kartaa kor u qaadista gaar ahaaneed iyo hufnaanta.Intaa waxaa dheer, waxaa lagama maarmaan ah in la hubiyo timaha timaha, heterodimers, iyo ismaandhaafka.

Fig3 oligo7 natiijooyinka ogaanshaha
Ogaanshaha waxtarka xoojinta:
Waxtarka waxtarka leh ee falcelinta PCR waxay si dhab ah u saamaysaa natiijooyinka PCR.Sidoo kale qRT-PCR, hufnaanta kordhintu waxay si gaar ah muhiim ugu tahay natiijooyinka tirada.Ka saar walxaha kale, mishiinada iyo borotokoollada ku jira kaydiyaha falcelinta.Tayada furayaasha ayaa waliba saameyn weyn ku leh waxtarka kordhinta qRT-PCR.Si loo hubiyo saxnaanta natiijooyinka, labadaba qiyaasta fluorescence-ka qaraabada ah iyo tirooyinka buuxa ee fluorescence labadaba waxay u baahan yihiin inay ogaadaan waxtarka kor u qaadida aasaasayaasha.Waxaa la aqoonsan yahay in hufnaanta qRT-PCR ee waxtarka leh ay u dhexeyso 85% iyo 115%.Waxaa jira laba hab:
1. Habka qalooca caadiga ah:
a.Isku qas cDNA
b.Si tartiib ah u milmay
c.qPCR
d.Isla'egta regression toos ah si loo xisaabiyo waxtarka weynaynta
2. LinRegPCR
LinRegPCR waa barnaamij loogu talagalay falanqaynta xogta RT-PCR ee waqtiga-dhabta ah, sidoo kale loo yaqaan xogta PCR ee tirada (qPCR) ee ku salaysan SYBR Cagaaran ama kiimiko la mid ah.Barnaamijku waxa uu adeegsadaa xog la saxay oo aan sal lahayn, waxa uu si gooni ah u sameeyaa sixitaan gundhig muunad kasta, waxa uu go'aamiyaa daaqada toosan ka dibna waxa uu isticmaalaa falanqaynta regression toos ah si uu ugu haboonaado xariiq toosan iyada oo loo marayo dejinta xogta PCR.Laga soo bilaabo jiirada xariiqan waxtarka PCR ee muunad kasta ayaa la xisaabiyaa.Waxtarka celceliska PCR halkii amplicon iyo qiimaha Ct ee muunad kasta ayaa loo isticmaalaa si loo xisaabiyo diiradda bilowga muunad kasta, oo lagu muujiyey unugyada fluorescence ee aan sabab lahayn.Gelida xogta iyo soo saarista waxay ku socotaa xaashida xaashida ee Excel.Muunad kaliya
isku dhafka ayaa loo baahan yahay, ma jiro gradient
talaabooyinka ayaa loo baahan yahay:(Tusaale ahaan u soo qaado Bole CFX96, maahan Mashiin leh ABI cad)
tijaabo:waa tijaabo qPCR caadi ah.
Soo saarista xogta qPCR:LinRegPCR waxay aqoonsan kartaa laba nooc oo faylal wax soo saar ah: RDML ama natiijada kordhinta tirada.Dhab ahaantii, waa qiimaha ogaanshaha wakhtiga dhabta ah ee lambarka wareegga iyo calaamadda fluorescence ee mishiinka, iyo kordhinta waxaa lagu helaa iyada oo la falanqeynayo qiimaha isbeddelka fluorescence ee waxtarka qaybta tooska ah.
Xulashada xogta: Aragti ahaan, qiimaha RDML waa in la isticmaalo.Waxaa lagu qiyaasaa in dhibka kombayutarkaygu yahay in software-ku aanu aqoonsan karin RDML, markaa waxaan haystaa qiimaha wax soo saarka ee excel sida xogta asalka ah.Waxaa lagu talinayaa in la sameeyo baaritaanka qallafsan ee xogta marka hore, sida guuldaradii ku darista shaybaarada, iwm. Dhibcaha waa la tirtiri karaa in xogta wax soo saarka (dabcan, iyaga ma tirtiri kartaa, LinRegPCR iska indha qodobadan marxaladda dambe)

Sawirka 5 qPCR xogta dhoofinta

Jaantuska6 xulashada musharraxiinta

Gelida xogta:Natiijooyinka cod-weyneysiinta ee furan

Sawirka 7 tillaabooyinka gelinta xogta linRegPCR

Natiijo:Haddii aysan jirin ku celcelin, looma baahna kooxaysi.Haddii ay soo noqnoqonayso, kooxaynta waxaa lagu tifatiri karaa kooxaynta muunadda, waxaana magaca hiddasidaha la geliyaa aqoonsiga, ka dibna isla hidde-sidaha si toos ah ayaa loo kooxeynayaa.Ugu dambeyntii, dhagsii faylka, dhoofinta Excel, oo arag natiijooyinka.Hufnaanta kordhinta iyo natiijooyinka R2 ceel kasta ayaa la soo bandhigi doonaa.Marka labaad, haddii aad u qaybiso kooxo, waxtarka kordhinta celceliska la saxay ayaa la soo bandhigi doonaa.Hubi in wax ku oolnimada cod-weyneeye kasta uu u dhexeeyo 85% iyo 115%.Haddii ay aad u weyn tahay ama aad u yar tahay, waxay la macno tahay in hufnaanta cod-weyneyayaashu ay liidato.

Jaantuska 8 Natiijada iyo soo saarista xogta

Habka tijaabada:
Shuruudaha tayada RNA:
daahirnimo1.72.0 waxay muujinaysaa inay jiri karto isothiocyanate haraaga ah.Nucleic acid A260 / A230 nadiif ah waa inay ahaataa agagaarka 2. Haddii ay jirto nuugista xooggan ee 230 nm, waxay muujinaysaa in ay jiraan xeryahooda organic sida ions phenate.Intaa waxaa dheer, waxaa lagu ogaan karaa 1.5% agarose gel electrophoresis.Tilmaan calaamadeeyaha, sababtoo ah ssRNA ma laha denaturation oo miisaanka molikula ee logarithm ma laha xiriir toos ah, miisaanka kelli si sax ah looma sheegi karo.Xoog saarid: Aragti ahaanmaahain ka yar 100ng/ul, haddii fiirsigu aad u hooseeyo, nadaafaddu guud ahaan waa mid hoose oo aan dheerayn

Fig9 RNA jel

Intaa waxaa dheer, haddii muunadku qaali yahay oo xoogga RNA uu sarreeyo, waxaa lagu talinayaa in la saaro ka dib marka la soo saaro, oo lagu milo RNA ilaa fiirsashada kama dambaysta ah ee 100-300ng / ul si loogu beddelo qoraalka.Gudahahabka dib u qorista, marka mRNA la qoro, oligo (dt) alwaaxyada si gaar ah ugu xidhi kara dabada polyA ayaa loo istcimaalaa qoraal gadaasha ah, halka lncRNA iyo circRNA isticmaalaan random hexamerShirkado badan ayaa hadda bilaabay xirmooyinka dabada gaarka ah.Habka loop-loop-ka, habka dawadu waa mid ku habboon,-soo saarid sare leh, iyo reagent-badbaadin, laakiin Saamaynta kala soocidda miRNA-yada isla qoyska waa inaysan u fiicnaan sida habka loop-loop.Xirmad kasta oo dib-u-celinta waxay leedahay shuruudo loogu talagalay fiirsashada hidde-sideyaasha asaasiga ah (stem-loops).Tixraaca gudaha ee loo isticmaalo miRNA waa U6.Inta lagu jiro habka isbedbeddelka stem-loop, tuubada U6 waa in si gooni ah loo rogaa, iyo hore iyo gadaal ee U6 waa in si toos ah loogu daraa.Labada cirRNA iyo lncRNA waxay isticmaali karaan HKGs tixraac gudaha ah.Gudahaogaanshaha cDNA,
Haddii aysan wax dhib ah ku jirin RNA, cDNA waa inay sidoo kale fiicnaataa.Si kastaba ha ahaatee, haddii kaamilnimada tijaabada la sii wado, waxaa fiican in la isticmaalo hiddasidaha tixraaca gudaha (Reference gene, RG) kaas oo ka sooci kara gDNA iyo cds.Guud ahaan, RG waa hidda-wadaha ilaalinta guriga., HKG) sida ku cad sawirka 10;Waqtigaas, waxaan samaynayey borotiinka kaydinta soybean, oo waxaan isticmaalay actin7 ka kooban introns ahaan tixraac gudaha ah.Cabbirka jajabka la xoojiyay ee asaasiga ah ee gDNA wuxuu ahaa 452bp, iyo haddii cDNA loo isticmaalay qaab template ah, waxay ahayd 142bp.Kadibna natiijadii imtixaanku waxay ogaatay in qayb ka mid ah cDNA ay dhab ahaantii wasakhaysay gDNA, waxayna sidoo kale cadaysay in aanay wax dhib ah ka jirin natiijada qoraalka qoraalka ah, waxaana loo isticmaali karaa qaab ahaan PCR.Waa wax aan faa'iido lahayn in agarose gel electrophoresis si toos ah ula socoto cDNA, waana koox fidsan, taas oo aan lagu qancin.

Jaantuska 10 ogaanshaha cDNA

Go'aaminta shuruudaha qPCRGuud ahaan wax dhib ah ma laha marka loo eego borotokoolka xirmada, inta badan marka la eego heerka qiimaha tm.Haddii qaar ka mid ah aasaasayaasha aan si fiican loo naqshadayn inta lagu jiro naqshadaynta asaasiga ah, taasoo keentay farqi weyn oo u dhexeeya qiimaha tm iyo aragtida 60 ° C, waxaa lagu talinayaa in cDNA ka dib marka shaybaarada la isku daro, ku socodsiiso PCR gradient leh alwaaxyo, iskuna day inaad iska ilaaliso inaad dejiso heerkulka iyada oo aan xirnayn sida qiimaha TM.

Falanqaynta xogta

Habka farsamaynta tireed ee fluorescence-ka caadiga ah ee PCR asal ahaan waa sida uu qabo 2-ΔΔCT.Qaabka habaynta xogta

Alaabooyinka La Xiriira:

Waqtiga dhabta ah PCR Easy^TM –Taqmaan

Waqtiga dhabta ah PCR Easy^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix oo loogu talagalay isku dhafka ugu horreeya ee cDNA)

RT Easy II (Master Premix-ka ugu horreeya ee cDNA synthesis ee qPCR)