Ⅰ. Kordhi dareenka habka falcelinta:
1. Kala soocida RNA tayo sare leh:
Isku dhafka cDNA ee guusha leh wuxuu ka yimid RNA tayo sare leh.RNA tayada sare leh waa in ay hubisaa ugu yaraan wadar ahaan in ay dheertahay oo kuma jiraan xannibaadaha aan ku jirin enzymes duubista, sida EDTA ama SDS.Tayada RNA ayaa go'aamisa qiimaha ugu badan ee xogta isku xigta ee aad u qori karto cDNA.Habka sifaynta guud ee RNA waa hab tallaabo ah oo loo isticmaalo isoocyanate/acidophenol.Si looga hortago wasakhowga RNase, RNA waxay ka soocday muunad qani ku ah RNase (sida beeryarada) waxay u baahan tahay kaydinta formaldehyde si loo badbaadiyo RNA tayo sare leh, taas oo xitaa aad uga sii badan kaydinta muddada dheer.RNA-da laga soo saaray beerka jiirka ayaa asal ahaan hoos u dhacday ka dib hal usbuuc oo lagu kaydiyo biyaha, halka RNA laga soo saaray beeryarada jiirka ay sii xasiloon tahay saddex sano oo biyo lagu kaydiyay.Intaa waxaa dheer, qoraalada ka weyn 4kb ayaa aad ugu nugul raadinta xaalufka RNase marka loo eego qoraalada yaryar.Si loo kordhiyo xasilloonida muunadda kaydinta RNA, RNA waxaa lagu milmi karaa methammamine of ion, waxaana lagu kaydiyaa -70 °C.Thylide loo isticmaalo in lagu badbaadiyo RNA waa in aanu ku jirin shay kala duwan oo hoos u dhigaya RNA.RNA, oo ka soo jeeda beeryarada, ayaa lagu badbaadin karaa methammamine ugu yaraan hal sano.Markaad diyaar u tahay inaad isticmaasho RNA, waxaad isticmaali kartaa hababka soo socda si aad u soo dejiso RNA: ku dar NaCl ilaa 0.2m iyo 4 jeer mugga ethanol, dhig heerkulka qolka 3-5 daqiiqo, iyo 10,000 × g centrifugal 5 daqiiqo.
2. Adeegso qoraal-ku-soo-noqod gadaal ah adiga oo aan hawsha RNaseH (RNaseH-):
Ka-hortaggayaasha RNase ayaa inta badan lagu daraa inay beddelaan falcelinta qoraalka si loo kordhiyo dhererka iyo dhalidda isku-dhafka cDNA.RNase inhibitor waxaa lagu daraa falcelinta silsiladda ugu horreysa ee joogitaanka kaydiyeyaasha iyo yaraynta wakiilada sida DTT sababtoo ah habka isku-darka pre-cDNA wuxuu diidaa xannibaadaha, taas oo sii deyneysa RNases xiran oo hoos u dhigaya RNA.Protein RNase inhibitor kaliya waxay ka hortagtaa nabaad-guurka RNA ee RNase A, B, C, kamana hortagto RNases maqaarka, markaa waa in laga taxadaraa in aan RNases ka soo galin faraha inkasta oo la isticmaalo ka hortaggaas.
Reverse transcriptase waxay kicisaa beddelka RNA ee cDNA.Labada M-MLV iyo AMV labaduba waxay leeyihiin waxqabad RNaseH ah oo ay weheliso nashaadkooda polymerase.Dhaqdhaqaaqa RNaseH wuxuu la tartamayaa dhaqdhaqaaqa polymerase ee xargaha heterozygous ee laga sameeyay inta u dhaxaysa qaababka RNA iyo asalka DNA ama xargaha fidinta cDNA, waxayna hoos u dhigtaa RNA: xargaha RNA ee dhismayaasha DNA-ga.Qaababka RNA ee ay hoos u dhigtay dhaqdhaqaaqa RNaseH looma isticmaali karo substrates wax ku ool ah isku-dhafka cDNA, yaraynta wax-soosaarka iyo dhererka isku-dhafka cDNA.Markaa baabi'inta ama si weyn loo dhimo waxqabadka RNaseH ee qoraalka qoraalka ah waxay noqon doontaa faa'iido weyn.
SuperScriptⅡ transcriptase gadaal, MMLV gadaashii qoraalka RNaseH- iyo thermoScript rogan qoraalka, AMV ee RNaseH- waxa uu keenay cDNA ka buuxa MMLV iyo AMV.Dareenka RT-PCR waxaa saameeya cadadka cDNA la sameeyay.ThermoScript aad ayuu uga xasaasisan yahay AMV.Baaxadda alaabada RT-PCR waxaa xaddiday awoodda qoraalka qoraalka dib loogu soo celinayo cDNA, gaar ahaan marka la xirayo Cdnas waaweyn.Marka la barbar dhigo MMLV, SuperScripⅡ waxay si weyn u kordhisay wax-soosaarka alaabada RT-PCR ee dheer.RNaseH-'s transcriptase-ka beddelka ayaa sidoo kale kordhiya xasilloonida kulaylka, markaa falcelinta waxaa lagu samayn karaa heerkul ka sarreeya heerka caadiga ah ee 37-42℃.Marka la eego shuruudaha isku dhafka ah ee la soo jeediyay, oligo(dT) asaasiga ah iyo 10μCi [alpha-p] dCTP ayaa la isticmaalay.Wadarta guud ee wax soo saarka silsiladda koowaad waxaa la xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo habka roobabka TCA.Dhererka cDNA oo buuxa ayaa la falanqeeyay iyadoo la isticmaalayo xariijimo cabbir leh oo ka saarista iyo tirinta jel agarose alkaline ah.
3. Kordhi heerkulka ilaalinta kulaylka ee qoraalka kale:
Heerkulka sare ee haynta waxay caawisaa in la furo qaab dhismeedka labaad ee RNA oo uu kordhiyo wax-soo-saarka falcelinta.Inta badan qaab-dhismeedka RNA, haysashada RNA iyo primer at 65°C iyada oo aan lahayn wax kaydin ama milix ah ka dibna si dhakhso ah loogu qaboojiyo barafka waxay tirtirtaa badi qaab-dhismeedka sare waxayna u ogolaataa furayaasha inay xidhaan.Si kastaba ha ahaatee, moodooyinka qaar ayaa weli leh qaab dhismeed sare, xitaa ka dib marka laga saaro kuleylka.Kordhinta hababkan adag waxa lagu samayn karaa iyada oo la adeegsanayo ThermoScript reverse transcriptase iyo iyada oo la gelinayo falcelinta transcriptase gadaasha heerkul sare si loo hagaajiyo xoojinta.Heerkulka sare ee haynta ayaa sidoo kale kordhin kara gaar ahaaneed, gaar ahaan marka isku-darka cDNA lagu sameeyo iyada oo la adeegsanayo aasaasayaasha hidda-sidaha gaarka ah (GSPS) (eeg cutubka 3).Haddii aad isticmaalayso GSP, hubi in qiimaha Tm ee furaha uu la mid yahay heerkulka la filayo.Ha isticmaalin oligo(dT) iyo qalabyada random ee ka sarreeya 60 ℃.Qoryaha aan sugnayn waxay u baahan yihiin in lagu hayo 25 ℃ 10 daqiiqo ka hor inta aan la gaarin 60 ℃.Marka lagu daro adeegsiga heerkul-ku-soo-noqod sare, gaar ahaanta waxaa lagu wanaajin karaa iyadoo si toos ah looga wareejinayo isku dhafka RNA/primer ee heerkulka 65 ℃ diidista heerkulka haynta iyo ku darida 2 × preheated reaction (CDNA).Habkani wuxuu kaa caawinayaa ka hortagga isku-xidhka saldhigga intermolecular ee ku dhaca heerkulka hoose.Isticmaalka aaladda PCR waxay fududaynaysaa daarannada heerkulka badan ee looga baahan yahay RT-PCR.
Kulaylka Tth ee polymerase wuxuu u shaqeeyaa sidii DNA polymerase joogitaanka Mg2+ iyo RNA polymerase ee joogitaanka Mn2+.Waxay ku hayn kartaa kulayl ilaa 65 ℃.Si kastaba ha ahaatee, joogitaanka Mn2+ inta lagu guda jiro PCR waxay yaraynaysaa daacadnimada, taas oo ka dhigaysa Tth polymerase mid aan ku habboonayn kor u qaadida saxsanaanta sare, sida cDNA cloning.Intaa waxaa dheer, Tth aad ayey ugu yar tahay qorista gadaasha, taas oo yaraynaysa dareenka, iyo maadaama hal enzym uu samayn karo dib u dhigista iyo PCR, falcelinta xakamaynta iyada oo aan lahayn qoraal gadaal ah looma isticmaali karo in lagu kala saaro alaabada la xoojiyay ee cDNA iyo kuwa DNA-da wasakhaysan.
4. Wax-ku-darka kor u qaada qoraal-celinta:
Ku-darka waxyaabaha lagu daro, oo ay ku jiraan glycerin iyo DMSO, falcelinta isku-dhafka silsiladda koowaad waxay yarayn kartaa xasilloonida xuddunta aashitada nucleic-ka waxayna furfuraysaa qaab-dhismeedka sare ee RNA.Ilaa 20% glycerin ama 10% DMSO waa lagu dari karaa iyada oo aan saamaynayn dhaqdhaqaaqa SuperScriptⅡ ama MMLV.AMV waxay sidoo kale u dulqaadan kartaa ilaa 20% glycerol iyada oo aan la dhimin dhaqdhaqaaqa.Si kor loogu qaado dareenka RT-PCR gudaha SuperScriptⅡ falcelinta qoraalka qoraalka, 10% glycerol ayaa lagu dari karaa oo lagu dahaaran karaa 45℃.Haddii 1/10 ee badeecada dib-u-celinta-retrotranscription-ka lagu daro PCR, fiirsashada glycerol ee falcelinta-weynaynta waa 0.4%, taas oo aan ku filnayn in la joojiyo PCR.
5. Habaynta RNaseH:
Dareenka waxaa lagu wanaajin karaa iyadoo lagu daweynayo falcelinta isku dhafka cDNA ee RNaseH kahor PCR.Qaar ka mid ah qaababka, waxaa loo maleynayaa in RNA ee falcelinta isku-darka cDNA ay ka hortagto xiritaanka alaabta la xoojiyay, taas oo daaweynta RNaseH ay kordhin karto dareenka.Guud ahaan, daawaynta RNaseH ayaa looga baahan yahay kordhinta qaab-dhismeedka cDNA oo dhererkiisu dhan yahay, sida scherosis Ⅱ tuberous oo koobbi hooseeya leh.Qaab-dhismeedkan adag, RNaseH waxay xoojisay calaamada ay dhaliso cDNA ee ay samaysay SuperScriptⅡ ama AMV.Inta badan falcelinta RT-PCR, daawaynta RNaseH waa ikhtiyaari sababtoo ah 95 ℃ dahaadhka PCR ee dahaaran ayaa caadi ahaan ka saara RNA ee RNA: DNA complex.
6. Hababka la hagaajiyay ee lagu ogaanayo xaddi yar oo RNA ah:
RT-PCR waxay si gaar ah u dhib badan tahay marka xaddi yar oo RNA ah la heli karo.Ku-darka glycogen sida side inta lagu jiro kala-soocidda RNA waxay gacan ka geysataa kordhinta wax-soo-saarka muunado yaryar.Glycogen-free RNase ah ayaa lagu dari karaa isla wakhtiga Trizol.Glycogen waa biyo-milmi kara waxayna ku sii jiri kartaa marxaladda biyaha RNA si ay uga caawiso roobabka xiga.Xaddiga lagu taliyey ee glycogen-ka-free RNase waa 250μg/ml ee muunado ka yar 50mg oo unug ama 106 unug dhaqan leh.
Ku darida BSA acetylated si loo rogo falcelinta qoraalka iyadoo la adeegsanayo SuperScriptⅡ waxay kordhin kartaa dareenka, iyo xaddi yar oo RNA ah, hoos u dhigista qadarka SuperScriptⅡ iyo ku darida 40 unug ee RnaseOut nuclease inhibitor waxay hagaajin kartaa heerka ogaanshaha.Haddii glycogen loo isticmaalo kala-soocida RNA, ku darida BSA ama RNase inhibitors si loo beddelo falcelinta qoraalka iyadoo la adeegsanayo SuperScriptⅡ ayaa wali lagu talinayaa.
Ⅱ. Kordhi qaaska ah ee RT-PCR
1. Isku-dhafka CNDA:
Saddex hab oo kala duwan ayaa loo isticmaali karaa in lagu bilaabo isku-darka cDNA-ga ugu horreeya, iyo gaarnimada hab kastaa waxay saamaysaa qaddarka iyo nooca cDNA-da la farsameeyey.
Habka asaasiga ah ee random waa kan ugu yar ee gaarka ah ee saddexda hab.Furayaasha waxaa lagu tirtiray goobo badan inta qoraalka lagu jiro si loo soo saaro cDNA gaaban oo qayb ah.Habkan waxaa badanaa loo isticmaalaa in lagu helo 5′ taxane terminal iyo cDNA oo laga helo moodellada RNA ee leh gobollo qaab dhismeed sare ah ama goobo joojinaya oo roga qoraalka qoraalka aan soo celin karin.Si loo helo cDNA-da ugu dheer, saamiga asaasiga ah iyo RNA ee muunad kasta oo RNA ah ayaa loo baahan yahay in si macquul ah loo go'aamiyo.Isku-dubaridka bilowga ah ee asaasiga ah wuxuu u dhexeeyaa 50 ilaa 250ng nidaamkii falcelinta 20μl.Sababtoo ah cDNA-da laga soo saaray wadarta RNA iyadoo la adeegsanayo aasaasayaasha random-ka ayaa inta badan ah RNA ribosomal, poly(A)+ RNA ayaa guud ahaan loo doortay qaab-dhismeedka.
Bilawga Oligo(dT) aad ayuu uga gaar yahay aasaasayaasha random.Waxay ku dhex milmay dabada poly(A) ee laga helo 3′ dhamaadka mRNA ee unugyada eukaryotic intooda badan.Sababtoo ah poly(A)+RNA waa qiyaastii 1% ilaa 2% wadarta guud ee RNA, cadadka iyo kakanaanta cDNA aad bay uga yar tahay haddii la isticmaalo asal-raacyo aan toos ahayn.Sababtoo ah gaar ahaanteeda sare, oligo(dT) guud ahaan uma baahna hagaajinta RNA ilaa saamiga asaasiga ah iyo poly(A)+ xulashada.Waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo 0.5μg oligo(dT) nidaamkii falcelinta 20μl.oligo(dT)12-18 waxay ku haboontahay inta badan RT-PCR.Nidaamka ThermoScript RT-PCR System wuxuu bixiyaa oligo(dT)20 sababtoo ah degenaanshihiisa kulaylka wanaagsan wuxuuna ku habboon yahay heerkulka haynta sare.
Aasaasayaasha hidda-sidaha gaarka ah (GSP) ayaa ah aasaasayaasha ugu wanaagsan ee u gaarka ah tallaabada dib u dhigista.GSP waa oligonucleoside-ka-hortagga ah kaas oo si gaar ah ugu milmi kara taxanaha meesha RNA, halkii uu ka saari lahaa dhammaan Rnas sida asaasiga random ama oligo (dT).Xeerarka loo isticmaalo qaabaynta asaasiga hore ee PCR waxay sidoo kale khuseeyaan naqshadaynta falcelinta qoraalka qoraalka GSP.GSP waxa ay noqon kartaa isku xigxig la mid ah sida primer-ka cod-weyneysiinta ee la dajiyay dhammaadka mRNA3′, ama GSP waxa loo qaabayn karaa in lagu xidho dhinaca hoose iyada oo la raacayo soodhaweynta cod-weyneeye.Qaar ka mid ah walxaha la xoojiyay, waxaa lagama maarmaan ah in la naqshadeeyo wax ka badan hal qoraha lidka ku ah ee RT-PCR ee guuleysta sababtoo ah qaabka labaad ee RNA bartilmaameedka ayaa laga yaabaa inuu ka ilaaliyo furaha inuu xiro.Waxaa la soo jeediyay in la isticmaalo 1pmol antisense GSP habka falcelinta silsiladda ugu horreysa ee 20μl.
2. Kordhi heerkulka ilaalinta kulaylka ee qoraalka gadaal:
Si looga faa'iidaysto gaar ahaan GSP, beddelka qoraalka qoraalka leh xasilloonida kulaylka sare waa in la isticmaalaa.transcriptase ka beddelka kulaylka-deggan waxa lagu dahaaran karaa heerkul sare si loo kordhiyo cadaadiska falcelinta.Tusaale ahaan, haddii GSP la tirtiro 55°C, markaas gaar ahaan GSP si buuxda looma faa'iidaysan karo haddii qoraalka dib u dhigista lagu sameeyo 37°C iyada oo la adeegsanayo AMV ama M-MLV.Si kastaba ha ahaatee, SuperScripⅡ iyo ThermoScript waxay kaga falcelin karaan 50℃ ama ka sareeya, taas oo meesha ka saaraysa badeecooyinka aan khaaska ahayn ee lagu soo saaro heerkul hoose.Gaar ahaan ugu badnaan, isku dhafka RNA/primer waxaa si toos ah looga wareejin karaa heerkulka 65 ℃ denaturation ilaa heerkulka haynta beddelka iyadoo lagu darayo isku dar ah falcelinta 2 x horay loo sii kululeeyay (bilawga kulaylka ee isku dhafka cDNA).Tani waxay kaa caawinaysaa ka hortagga isku-duubnaanta salka u dhexeeya molecules heerkulka hooseeya.Isticmaalka aaladda PCR waxay fududaynaysaa kala-guurka heerkulka badan ee looga baahan yahay RT-PCR.
3. Yaree wasakhowga DNA-da genomic:
Mid ka mid ah dhibaatooyinka suurtagalka ah ee RT-PCR waa in RNA ay wasakhayso DNA-da genomic.Isticmaalka hababka kala soocida RNA ee wanaagsan, sida Trizol Reagent, waxay yaraynaysaa wasakhaynta DNA-da ee diyaarinta RNA.Si looga fogaado alaabada laga soo saaro DNA-da genomic, RNA waxaa lagu daawayn karaa darajada DnasⅠ si kor loogu qaado DNA-da wasakhaysan ka hor inta aan dib loo rogin.Tijaabooyinku waxa lagu hayaa 65℃ gudaha 2.0mM EDTA 10 daqiiqo si loo joojiyo dheefshiidka DNA-ga.EDTA waxay chelates ion magnesium si ay uga hortagto RNA hydrolysis ku tiirsan magnesium ion ee ku dhaca heerkulka sare.
Si loo kala saaro cDNA-da la xoojiyay iyo sheyga xoojinta DNA-ga genome, alwaaxyada si goonida u baabi'iya exon-ka goonida ah ayaa la qaabayn karaa.Alaabooyinka PCR ee laga soo qaatay cDNA waxay ka gaaban doonaan kuwa laga soo qaatay DNA-da genomic ee wasakhaysan.Tijaabo la kontoroolo oo aan lahayn qoraal gadaal ah ayaa sidoo kale lagu sameeyaa qaab-dhismeedka RNA kasta si loo go'aamiyo in qayb la bixiyay ay ka timid DNA-da genomic ama cDNA.Badeecadaha PCR ee la helay maqnaanshaha qoraalka dib u noqoshada ayaa laga soo qaatay genome-ka.
Alaabta laxidhiidha
-Qalabka hal-tallaabo ah ayaa awood u siinaya qoraal-ku-noqoshada iyo PCR in lagu sameeyo isla tuubo isku mid ah.Waxa kaliya oo ay u baahan tahay in lagu daro template RNA, asal PCR gaar ah iyo ddH-RNase-free2O.
-Waqtiga-dhabta ah ee falanqaynta tirada RNA waxaa loo samayn karaa si degdeg ah oo sax ah.
-Qalabkani waxa uu isticmaalayaa reagent transcription u gaar ah Foregene iyo Foregene HotStar Taq DNA Polymerase oo ay weheliso nidaam falcelin gaar ah si ay si wax ku ool ah u wanaajiso waxtarka xoojinta iyo gaar ahaaneed ee falcelinta.
-Nidaamka falcelinta ee la wanaajiyey ayaa ka dhigaysa fal-celintu inay yeelato dareen sare oo lagu ogaanayo, xasilloonida kulaylka oo xoog badan, iyo dulqaad wanaagsan.
-Awood waxtar leh oo looga saarayo gDNA, taas oo ka saari karta gDNA qaab-dhismeedka 2 daqiiqo gudahood.
-Nidaamka dib-u-dejinta oo hufan, waxay qaadataa 15 daqiiqo oo keliya in la dhammaystiro isku-darka cDNA-ga ugu horreeya.
Hababka isku dhafan: qaab-dhismeedka ka kooban GC-ga sare iyo qaab-dhismeedka sare ee adag ayaa sidoo kale lagu beddeli karaa hufnaan sare.
-Nidaamka qoraalka dib u celinta dareenka sare, jaantusyada heerka pg sidoo kale waxay heli karaan cDNA tayo sare leh.
-Nidaamka qoraalka dib u celinta ayaa leh xasillooni kulayl sare leh, heerkulka falcelinta ugu fiican waa 42 ℃, walina waxay leedahay wax qabad wanaagsan oo qoraal ah 50 ℃.
Waqtiga boostada: Mar-07-2023
