Waxaa si fiican loo og yahay in dogma dhexe, RNA ay tahay dhexdhexaadiyaha qoraalka ee u dhexeeya DNA iyo muujinta borotiinka.Marka la barbar dhigo ogaanshaha DNA-da, ogaanshaha RNA wuxuu si hufan u muujin karaa muujinta hidde-sidaha noolaha.Tijaabooyinka ku lug leh RNA waxaa ka mid ah: qRT-PCR, RNA-Seq, iyo ogaanshaha hidda-wadaha fusion, iwm. Iyada oo ku saleysan sifooyinka RNA lafteeda (giraanta sonkorta RNA waxay leedahay hal koox oo hydroxyl ah oo bilaash ah marka loo eego giraanta sonkorta DNA), oo ay weheliso tiro badan oo RNases ah oo deegaanka ah, RNA waa mid aan xasilloonayn oo ay fududahay in la dumiyo DNA-da.Qashinka gudaha, qashinka, haddii tayada RNA aysan fiicnayn, markaa natiijooyinka tijaabada ah waa inay noqdaan kuwo aan lagu qancin, gaar ahaan loo muujiyo xog aan sax ahayn ama dib-u-celin liidata.Sidaa darteed, fiiro gaar ah waa in la siiyaa habaynta RNA, iyo isku xirka xakamaynta tayada ayaa sidoo kale aad muhiim u ah si loo hubiyo saxnaanta iyo saxnaanta xogta tijaabada ah ee xigta.

Xakamaynta tayada RNA, guud ahaan waxaa jira hababka soo socda ee inta badan la isticmaalo:

• Spectrophotometry
• agarose jel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• wakhtiga dhabta ah ee fluorescent quantitative PCR
• Habka dheeha ee Qubit

01 Spectrophotometry

RNA waxa ay leedahay isku xidhid labanlaab ah oo waxa ay leedahay nuugista ugu saraysa ee mawjada dhererka 260nm.Marka loo eego sharciga Lambert-Beer, waxaan ka xisaabin karnaa xoogga RNA ee nuugista ugu sarreysa 260nm.Intaa waxaa dheer, waxaan sidoo kale xisaabin karnaa nadiifnimada RNA iyadoo loo eegayo saamiga 260nm, 280nm iyo 230nm ugu sarreeya nuugista.280nm iyo 230nm waa meesha ugu sarreysa nuugista borotiinnada iyo unugyadu yaryar, siday u kala horreeyaan.Saamiga A260/A280 iyo A260/A230 ee nadiifnimada RNA ee u qalma waa in uu ka weynaadaa 2. Haddii ay ka yar tahay 2, waxa ay la macno tahay in ay jirto wasakhayn borotiin ama unug yar oo ku jirta muunadda RNA oo loo baahan yahay in mar kale la nadiifiyo.Ilaha faddarayntu waxay saamaynaysaa tijaabooyinka hoose, sida in la joojiyo hufnaanta wax-ku-oolnimada falcelinta PCR, taasoo keenta natiijooyin aan sax ahayn.Nadiifinta RNA waxay saameyn weyn ku leedahay natiijooyinka xiga, sidaa darteed spectrophotometry guud ahaan waa isku xirka xakameynta tayada lagama maarmaanka ah ee talaabada ugu horeysa ee tijaabooyinka aashitada nucleic.

Jaantuska 1. Caadiga ah ee RNA/DNA Nuugista Spectrum

02 Agarose jel electrophoresis

Marka lagu daro daahirnimada, daacadnimada RNA waa mid ka mid ah tilmaamayaasha muhiimka ah ee lagu qiimeeyo tayada RNA.Burburinta RNA waxay u horseedi doontaa tiro badan oo jajab gaaban oo muunad ah, markaa tirada jajabyada RNA ee si wax ku ool ah loo ogaan karo oo lagu dabooli karo taxanaha tixraaca waa la dhimi doonaa.Hufnaanta RNA waxaa lagu hubin karaa elektrophoresis wadarta guud ee RNA ee jel agarose 1% ah.Habkani waxa uu isku habayn karaa jel-ka laftaada, ama waxa uu isticmaali karaa nidaamka E-Gel™ ee la sii diyaariyay si aad u tijaabiso daacadnimada.In ka badan 80% wadarta guud ee RNA waa RNA ribosomal, kuwaas oo badidoodu ka kooban yihiin 28S iyo 18S rRNA (nidaamka naasleyda).Tayada wanaagsan ee RNA waxay tusi doontaa laba baarar oo dhalaalaya oo muuqda, kuwaas oo ah 28S iyo 18S baararka dhalaalaya, siday u kala horreeyaan, 5 Kb iyo 2 Kb, saamiguna wuxuu u ekaan doonaa inuu ku dhawaado 2:1.Haddii ay ku jirto xaalad fidsan, waxay la macno tahay in saamiga RNA uu hoos u dhacay, waxaana lagu talinayaa in la isticmaalo habka lagu sharraxay hadhow si loo sii tijaabiyo tayada RNA.

Jaantuska 2. Isbarbardhigga hoos-u-dhaca (haadka 2) iyo RNA-da (haadka 3) ee aan saxnayn ee ku yaal agarose gel electrophoresis

03 Agilent Bioanalyzer

Marka lagu daro habka loo yaqaan 'agarose gel electrophoresis' ee kor lagu sharaxay, kaas oo naga caawin kara inaan ogaano daacadnimada RNA si fudud oo degdeg ah, waxaan sidoo kale u isticmaali karnaa bioanalyzer Agilent si loo go'aamiyo daacadnimada RNA.Waxay isticmaashaa isku-darka microfluidics, electrophoresis capillary, iyo fluorescence si loo qiimeeyo xoojinta RNA iyo daacadnimada.Adigoo isticmaalaya algorithm-ku-dhismay si loo falanqeeyo astaanta shaybaarka RNA, Agilent bioanalyzer wuxuu xisaabin karaa tixraaca qiimaha daacadnimada RNA, Nambarka Integrity RNA (oo hadda loo yaqaan RIN) [1].Marka uu bato qiimaha RIN, waxa sare u kacaya daacadnimada RNA (1 aad buu u hoos u dhacay, 10 ayaa ah kan ugu dhammaystiran).Tijaabooyin qaarkood oo ku lug leh RNA waxay soo jeedinayaan in RIN loo isticmaalo qiyaas ahaan qiimaynta tayada.Qaadashada tijaabooyin isku xigxig ah oo heersare ah (oo hadda loo yaqaan NGS) tusaale ahaan, tilmaamaha Oncomine ™ Human Immune Repertoire, kaas oo loo isticmaalo in lagu ogaado unugyada B unugga iyo T unugyada antigen-ka ee taxanaha Thermo Fisher's Oncomine panel, waxay soo jeedinayaan muunado leh RIN qiyam ka weyn 4, Akhris waxtar badan leh iyo xidhidh ayaa la qiyaasi karaa.Waxaa jira noocyo kala duwan oo lagu taliyay oo loogu talagalay baalal kala duwan, iyo inta badan RIN sare waxay keeni kartaa xog waxtar leh.

Jaantuska 3, ee Oncomine™ Tijaabooyinka Dib-u-Immune Immune Repertoire, muunado leh RIN ka weyn 4 waxay ogaan karaan wax akhrinta waxtarka leh iyo T-yada unugyada.【2】

Si kastaba ha ahaatee, qiimaha RIN wuxuu kaloo leeyahay xaddidaadyo.Inkasta oo RIN ay xidhiidh sare la leedahay tayada xogta tijaabada ah ee NGS, kuma habboona muunadaha FFPE.Muunada FFPE si kiimiko ah ayaa loo daweeyay muddo dheer, RNA-ga la soo saarayna guud ahaan waxa ay leedahay qiime RIN ah oo aad u hooseeya.Si kastaba ha ahaatee, tani macnaheedu maaha in xogta waxtarka leh ee tijaabada ah ay tahay inay noqoto mid aan ku qanacsanayn.Si aan si sax ah u qiimeyno tayada shaybaarada FFPE, waxaan u baahanahay inaan isticmaalno qiyaaso aan ahayn RIN.Marka lagu daro RIN, Agilent bioanalyzer waxa kale oo uu xisaabin karaa qiimaha DV200 sida cabbirka qiimaynta tayada RNA.DV200 waa halbeeg xisaabiya saamiga jajabyada ka weyn 200 bp ee muunada RNA.DV200 waa tilmaame ka wanaagsan tayada muunadda FFPE marka loo eego RIN.RNA-ga ay soo saartay FFPE, waxa ay xidhiidh aad u saraysa la leedahay tirada hiddo-sideyaasha si wax ku ool ah loo ogaan karo iyo kala duwanaanshaha hidde-sideyaasha [3].In kasta oo DV200 ay wax ka qaban karto cilladaha ku jira ogaanshaha tayada FFPE, Agilent bioanalyzer weli si buuxda uma falanqeyn karo dhibaatooyinka tayada ee shaybaarada RNA, oo ay ku jiraan haddii ay jiraan xannibaado shaybaarada.Kahortagga laftoodu waxay saameyn karaan waxtarka xoojinta ee tijaabooyinka hoose waxayna yareeyaan cadadka xogta waxtarka leh.Si loo ogaado haddii uu jiro hor-jooge ku jira muunada, waxaan qaadan karnaa habka saxda ah ee cabirka PCR-ga ee lagu sharraxay kan xiga.

04 wakhtiga dhabta ah ee fluorescent quantitative PCR

Habka waqtiga-dhabta ah ee fluorescent tire PCR kaliya ma ogaan karo horjoogayaasha muunada, laakiin sidoo kale waxay si sax ah uga tarjumaysaa tayada RNA ee muunada FFPE.Marka la barbar dhigo Agilent falanqeeyayaasha bayooloji, qalabka tireed ee waqtiga-dhabta ah ee fluorescence ayaa aad caan uga ah shaybaarada waaweyn ee bayoolojiga codsigooda ballaaran awgeed.Si loo tijaabiyo tayada shaybaarada RNA, waxaan u baahanahay oo kaliya inaan soo iibino ama u diyaarino baaritaanada asaasiga ah ee hiddo-wadaha tixraaca gudaha, sida GUSB (Cat no. Hs00939627).Adigoo isticmaalaya cutubkan aasaasiga ah, shaybaarrada iyo jaangooyooyinka (wadarta guud ee RNA ee xoogga la og yahay) si loo sameeyo tijaabooyin qiyaaseed dhammaystiran, xoogga saarista jajabka RNA ee waxtarka leh waxaa loo xisaabin karaa heerka qiimaynta tayada RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) oo gaaban).Imtixaankii NGS, waxaan ku ogaanay in FRQ ee muunadaha RNA ay leeyihiin xiriir aad u sarreeya oo leh mugga xogta waxtarka leh.Dhammaan muunadaha ka weyn 0.2ng/ul FRQ, ugu yaraan 70% akhristayaasha ayaa si wax ku ool ah u dabooli kara taxanaha tixraaca (Jaantuska 4).

Jaantuska 4, qiimaha FRQ ee lagu ogaado habka qiyaasta fluorescence ayaa leh xiriir aad u sarreeya (R2> 0.9) oo leh xogta waxtarka leh ee laga helay tijaabada NGS.Xariiqda cas waa qiimaha FRQ oo le'eg 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Marka laga soo tago in lagu dabaqi karo shaybaarada FFPE, habka waqtiga-dhabta ah ee PCR ayaa sidoo kale si wax ku ool ah ula socon kara horjoogayaasha shaybaarada.Waxaan ku dari karnaa muunada in lagu ogaado nidaamka falcelinta oo leh Xakamaynta Wanaagsan ee Gudaha (IPC) iyo Assay, ka dibna waxaan samayn karnaa tirooyinka fluorescence si loo helo qiimaha Ct.Haddii qiimaha Ct uu ka danbeeyo qiimaha Ct ee falcelinta muunad-la'aanta ah, waxay muujinaysaa in xannibayuhu uu ku jiro muunadda oo uu joojiyo waxtarka xoojinta falcelinta.

05 Habka dheeha ee Qubit fluorescent

Qubit Fluorometer waa aaladda ugu badan ee loo isticmaalo fiirsashada aashitada nucleic-ka ah iyo ogaanshaha nadiifka, kaas oo ay fududahay in lagu shaqeeyo oo ka jira ku dhawaad ​​shaybaar kasta oo bayoolajiga unugyada.Waxay si sax ah u xisaabisaa uruurinta aashitada nucleic-ka iyadoo la ogaanayo iyo dheeha aashitada nucleic-ku xiran ee fluorescent (Qubit detection reagent).Qubit wuxuu leeyahay dareen sare iyo gaar gaar ah, wuxuuna si sax ah u qiyaasi karaa RNA ilaa pg/µL diiradda.Marka laga soo tago awoodda caanka ah ee si sax ah loo qiyaaso fiirsashada aashitada nucleic, Thermo Fisher moodelkii ugu dambeeyay ee Qubit 4.0, wuxuu sidoo kale ogaan karaa daacadnimada RNA.Nidaamka ogaanshaha RNA ee Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) wuxuu ogaadaa daacadnimada RNA isagoo si isku mar ah u ogaanaya laba midab oo gaar ah.Labadan midab ee fluorescent waxay ku xidhi karaan jajabyo waaweyn iyo jajabyo yaryar oo RNA ah, siday u kala horreeyaan.Labadan midab ee fluorescent waxay muujinayaan saamiga qaybo waaweyn oo RNA ah oo ku jira muunada, tanna qiimaha IQ (Integrity and Quality) ee matalaya tayada RNA waa la xisaabin karaa.Qiimaha IQ waa mid lagu dabaqi karo FFPE iyo kuwa aan FFPE ahayn labadaba, waxayna saameyn weyn ku leedahay tayada isku xigxiga ee xiga.Qaadashada tijaabooyinka NGS tusaale ahaan, tijaabooyinka tijaabada RNA-Seq ee lagu sameeyay goobta Ion torrent ™, muunado badan oo leh qiyamka IQ ee ka weyn 4 waxay lahaayeen ugu yaraan 50% akhrin wax ku ool ah (Jaantuska 5).Marka la barbar dhigo hababka ogaanshaha ee kor ku xusan, Qubit IQ Assay kaliya maaha mid ku habboon in la shaqeeyo oo waxay qaadataa wakhti yar (shan daqiiqo gudahood), laakiin sidoo kale waxay leedahay xidhiidh weyn oo u dhexeeya qiyaasta qiyaasta IQ qiimaha iyo tayada xogta ee tijaabooyinka hoose.

Jaantuska 5, waxa jira xidhiidh weyn oo ka dhexeeya qiimaha Qubit RNA IQ iyo akhrinta khariidad ee RNA-Seq.【5】

Hordhaca kore, waxaan aaminsanahay in qof walba uu leeyahay faham ku filan oo ku saabsan hababka kala duwan ee ilaalinta tayada RNA.Ficil ahaan, waad dooran kartaahabka u dhigma iyadoo loo eegayo nooca muunada iyo qalabka jira.Kaliya in la xakameeyo tayada RNA si fiican ayaan uga fogaan karnaa guuldarada tijaabooyinka dambe ee ay sababaan muunada tayada liidata, sidaas darteed badbaadinta waqti qaali ah, tamar iyo kharash.

Alaabta tixraaca:

Wadarta Xayawaanka Qalabka Go'doonka RNA

Qalabka Go'doominta unugga ee RNA

tixraacyo

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. iyo al.RIN-gu: waa nambarka daacadnimada RNA si loogu meeleeyo qiyamka daacadnimada cabbirada RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Tusaha Isticmaalaha Dib-u-Celinta Difaaca Aadanaha ee Oncomine (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Halbeegyada Tayada La Wanaajiyay ee Qiimaynta RNA oo laga soo qaatay Muunado Tissue ah 73,https://doi.org/10.1093/toxsci/