1. Fahamka hore

Marxaladdan, waxaan u baahannahay inaan fahamno fikradaha iyo erey-bixinta qaarkood, si aan uga fogaanno khaladaad ka hor imaanaya waayeelkayaga, sida:

S: Waa maxay faraqa u dhexeeya RT-PCR, qPCR, PCR-waqtiga-dhabta ah, iyo RT-PCR-waqtiga-dhabta ah?

Jawaab: RT-PCR waa PCR-ga beddelka qoraalka(Reverse transcription PCR, RT-PCR), kaas oo ah nooc si weyn loo isticmaalo ee falcelinta silsiladda polymerase (PCR).Gudaha RT-PCR, xargaha RNA ayaa loo rogaa DNA-ga dhammaystiran, ka dibna loo isticmaalo qaab-dhismeedka DNA-da ee PCR.
Waqtiga-dhabta ah-PCR iyo qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) waa isku shay, labaduba waa PCR-ta dhabta ah, taas oo macnaheedu yahay in wareeg kasta oo PCR ah uu leeyahay diiwaannada xogta wakhtiga-dhabta ah, sidaa darteed tirada qaababka bilawga ah ayaa lagu hagaajin karaa falanqaynta saxda ah.

In kasta oo labadaba PCR-da-waqtiga-dhabta ah (Real-time fluorescent quantitative PCR) iyo Reverse transcription PCR (Reverse transcription PCR) ay u muuqdaan in loo soo gaabiyo RT-PCR, heshiiska caalamiga ahi waa: RT-PCR si gaar ah waxaa loola jeedaa qoraalka dib u noqoshada.PCR , PCR-waqtiga-dhabta ah waxaa guud ahaan loo soo gaabiyaa qPCR (tirada wakhtiga dhabta ah PCR).

Iyo RT-PCR (RT-qPCR)-waqtiga-dhabta ah, waa PCR-ga beddelka qoraalka oo ay weheliso tignoolajiyada tirada fluorescent.: marka hore ka hel cDNA (RT) ka tarjumida RNA, ka dibna u isticmaal PCR-waqtiga dhabta ah falanqaynta tirada (qPCR).Shaybaarada intooda badani waxay sameeyaan RT-qPCR, taas oo ah, cilmi baaris ku saabsan muujinta RNA hoos u dhigista, markaa qPCR ee qof kastaa kaga hadlo shaybaarka dhab ahaantii wuxuu tixraacayaa RT-qPCR, laakiin ha iloobin in ay jiraan baaritaano badan oo DNA ah oo ku jira codsiyada kiliinikada.Falanqaynta tirada, sida fayraska cagaarshow B ogaanshaha HBV.

Su'aal: Kadib akhrinta PCR badan oo fluorescent ah, maxay tahay sababta jajabka la xoojiyay loogu xakameynayo inta u dhaxaysa 80-300bp?

Jawaab: Dhererka taxanaha hidde kasta waa ka duwan yahay, qaar waa dhowr kb, qaar waa boqolaal bp, laakiin waxaan kaliya u baahanahay inaan u baahanahay dhererka badeecada inuu noqdo 80-300bp marka la naqshadeynayo aasaasayaasha, aad u gaaban ama aad u dheer kuma habboona ogaanshaha tirada PCR ee fluorescent.Kala qaybsanaanta badeecadu aad bay u gaaban tahay in laga sooci karo primer-dimer.Dhererka alwaax-dimerku wuxuu ku saabsan yahay 30-40bp, wayna adagtahay in la kala saaro haddii uu yahay dimer-dimer ama alaab haddii uu ka yar yahay 80bp.Haddii jajabka alaabtu aad u dheer tahay, ka badan tahay 300bp, waxay si fudud u horseedi doontaa waxtarka xoojinta hoose oo si wax ku ool ah uma ogaan karto qadarka hidda-wadaha.

Tusaale ahaan, marka aad tiriso inta qof ee ku jirta fasalka, waxaad u baahan tahay oo kaliya inaad tiriso inta af ee jira.Isla sidaas oo kale ayaa run ah marka aad ogaato hiddo-wadaha, kaliya waxaad u baahan tahay inaad ogaato taxane gaar ah oo hidde-sidaha ah si aad u matasho taxanaha oo dhan ayaa sameyn doona.Haddii aad doonayso inaad dadka tiriyo, waxaad u baahan tahay inaad tiriso labada af iyo sanka, dhegaha, iyo muraayadaha, waana sahlan tahay inaad khalad samayso.

Si loo ballaariyo, cilmi-baarista bayoolojiga, waxaa jira kiisas badan oo cilmi baaris ah min dhibic ilaa aag, sababtoo ah taxanaha hidda-socodka ee nooc kasta waa mid aad u dheer, waa wax aan loo baahnayn oo aan macquul ahayn in la cabbiro dhammaan jajabyada, sida bakteeriyada 16S sequencing, taas oo ah in la fuliyo taxanaha muxaafidka ah ee bakteeriyada Assays si loo qiyaaso tirada dad gaar ah oo bakteeriyada ah.

S: Waa maxay dhererka ugu fiican ee naqshadaynta asaasiga ah ee qPCR?

Jawaab: Guud ahaan marka loo hadlo, dhererka asaasiga ahi wuxuu ku saabsan yahay 20-24bp, taas oo ka fiican.Dabcan, waa in aan fiiro gaar ah u leenahay qiimaha TM ee asaasiga ah marka la naqshadeynayo asaasiga ah, sababtoo ah tani waxay la xiriirtaa heerkulka ugu fiican ee annealing.Tijaabooyin badan ka dib, waxa la caddeeyey in 60°C uu yahay qiimaha TM ka wanaagsan.Haddii heerkulku aad u hooseeyo, waxay si fudud u horseedi doontaa kor u qaadis aan gaar ahayn.Haddii heerkul-ku-qaadku aad u sarreeyo, wax-ku-oolnimada kor-u-qaadistu waxay ahaan doontaa mid aad u hooseeya, heerka ugu sarreeya ee qalooca cod-weyneyntu wuxuu bilaabi doonaa mar dambe, qiimaha CT-ga ayaa dib loo dhigi doonaa.

S: Sidee buu habka dheehku kaga duwan yahay habka baaritaanka?

Jawaab: Habka dheehaQaar ka mid ah midabada fluorescent, sida SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, iwm, kama soo baxaan iftiin naftooda, laakiin waxay sii daayaan fluorescence ka dib markay ku xidhaan jeexdin yar ee DNA-da laba-geesoon.Sidaa darteed, bilawga falcelinta PCR, mashiinku ma ogaan karo calaamadda fluorescent.Marka falcelintu gaadho heerka xinjirowga-kordhinta, xadhigga labanlaaban waa la furayaa, oo xadhig cusub ayaa la sameeyay iyada oo hoos timaad ficilka DNA polymerase, iyo molecule-ka fluorescent wuxuu ku xidhaa godka yar ee dsDNA.Marka tirada wareegyada PCR ay korodho, midabyo badan oo badan ayaa lagu daraa DNA-ga laba-geesoodka ah, iyo calaamadda fluorescent sidoo kale si joogto ah ayaa loo xoojiyaa.Habka dheeha waxaa inta badan loo adeegsadaa cilmi baarista sayniska.
PS: Ka digtoonow marka aad samaynayso tijaabada, dheehu waa in lagu daraa DNA-da bini'aadamka, ka taxaddar inaad u beddesho qof fluorescent ah.

Habka dheeha (bidix) Habka baaritaanka (midig)
PS: Ka digtoonow marka aad samaynayso tijaabada, dheehu waa in lagu daraa DNA-da bini'aadamka, ka taxaddar inaad u beddesho qof fluorescent ah.

SYBR Cagaaran Ⅰ waxay ku xidhan tahay jeexdin yar ee DNA

Habka baaritaankaBaaritaanka Taqman waa baaritaanka ugu badan ee la isticmaalo.Waxaa jira koox fluorescent ah oo ku taal dhamaadka 5′ ee baaritaanka, badanaa FAM, baaritaanka laftiisana waa taxane kaabaya hidda-sidaha la beegsanayo.Dhammaadka 3'aad waxa jira koox damaysa fluorescent.Marka loo eego mabda'a wareejinta tamarta resonance fluorescence (Förster resonance energy transfer, FRET), marka kooxda weriyaha fluorescent ah (deeqaha fluorescent molecule) iyo kooxda quenching fluorescent ah (aqbala fluorescent molecule) ay ku faraxsan yihiin Marka spectra is dulfuulan iyo masaafada aad u dhow yahay (7-10nm ee fluorescent ah), molecule, halka autofluorescence uu daciifo.Sidaa darteed, bilawga falcelinta PCR-ga, marka baaritaanku uu xor yahay oo uu ku jiro nidaamka, kooxda fluorescent weriyaha ma siidayn doonto fluorescence.Marka la tirtirayo, furaha iyo baaritaanka waxay ku xiran yihiin qaabka.Inta lagu jiro marxaladda fidinta, polymerase wuxuu si joogto ah u farsameeyaa silsilado cusub.polymerase DNA wuxuu leeyahay 5'-3' dhaqdhaqaaqa exonuclease.Marka la gaaro baaritaanka, polymerase-ka DNA-ga wuxuu biyo-baarijin doonaa baaritaanka qaab-dhismeedka, wuxuu ka sooci doonaa kooxda fluorescent weriyaha iyo kooxda fluorescent-ka, oo sii deyn doona calaamada fluorescent.Maadaama uu jiro xidhiidh mid-ka-mid ah oo u dhexeeya baaritaanka iyo qaab-dhismeedka, habka baaritaanka ayaa ka sarreeya habka dheeha marka loo eego saxnaanta iyo dareenka imtixaanka.Habka baaritaanka waxaa inta badan loo adeegsadaa baaritaanka.

S: Waa maxay qiyaasta saxda ah?Waa maxay Tirooyinka Qaraabo?

JawaabTiro dhammaystiran waxa loola jeedaa xisaabinta nambarka koobiga bilowga ah ee muunadda lagu tijaabinayo qPCR, sida inta jeer ee fayraska HBV ku jiraan 1ml oo dhiig ah.Natiijooyinka lagu helay qiyaasid qaraabo waa isbeddelka qaddarka hiddo-wadaha bartilmaameedka ee muunad gaar ah marka loo eego muunadda tixraaca kale, iyo muujinta hidde-sidaha waa mid la habeeyey ama hoos loo dhigay.

S: Qadarka soo saarista RNA, dib u noqoshada waxtarka qoraalka, iyo waxtarka kordhinta ma saameyn doontaa natiijooyinka tijaabada ah?
S: Kaydinta muunada, reageyaasha soo saarista, reagents-ka-beddelka qoraalka, iyo agabka gudbinta iftiinka saamayn ma ku yeelan doonaan natiijooyinka tijaabada?
S: Qaabkee ayaa sixi kara xogta tijaabada ah?

Arrimahan, waxaanu si faahfaahsan ugu qeexi doonaa qaybaha hore iyo kuwa horumarsan ee hoose.
2. Aqoon sare

Marka la eego waqtiga-dhabta ah ee PCR-ga fluorescent-ka, waa in aan aqoonsanno xaqiiqada ah in kumanaan waraaqo cilmi-baaris cilmiyeed ah la daabaco sannad kasta, kuwaas oo tikniyoolajiyadda PCR-ga ee fluorescent-ka aysan ahayn tiro yar.

Haddii aanu jirin halbeeg caadi ah oo lagu cabbiro tijaabada PCR ee tirooyinka fluorescent, natiijadu way kala duwanaan kartaa.Hidde-side isku mid ah oo isku nooc ah, oo leh hab habayneed isku mid ah, natiijooyinka ogaanshaha sidoo kale aad bay u kala duwanaan doonaan, wayna adkaan doontaa kuwa dambe inay ku celiyaan natiijooyin isku mid ah.Midna ma garanayo kan saxan iyo kan qaldan.

Tani miyay ka dhigan tahay in PCR-ga tirada badan ee fluorescent ay tahay tignoolajiyada khiyaameeya ama tignoolajiyada aan la isku halayn karin?Maya, waa sababta oo ah PCR tirooyinka fluorescent ayaa aad xasaasi u ah oo aad u saxsan, iyo hawl yar oo khaldan waxay soo saari doontaa natiijooyin gebi ahaanba iska soo horjeeda.Khasaare yar ayaa kun mayl u jira.Qoraaga maqaalka waxaa laga yaabaa in si isdaba joog ah loo jirdilo dib-u-eegayaashu.Isla mar ahaantaana, dib-u-eegayaasha joornaalka ayaa sidoo kale ku adag inay doortaan natiijooyin tijaabo oo kala duwan.

Dhammaan, oo tilmaamaya la'aanta is-afgarad la'aanta tijaabooyinka PCR ee waqtiga-dhabta ah.Si taas loo gaaro, saynisyahano sare ee warshadaha waxay bilaabeen inay dejiyaan heerar,u baahan ka qaybqaatayaasha inay bixiyaan xoogaa tijaabo ah oo lagama maarmaan ah faahfaahinta habaynta xogta (ay ku jirto xogta lagama maarmaanka ah) ee maqaalka si loo buuxiyo heerarkan.

Dib-u-eegayaashu waxay xukumi karaan tayada tijaabada iyagoo akhrinaya faahfaahintan;Akhristayaasha mustaqbalka waxay sidoo kale u isticmaali karaan tan si ay ugu celiyaan tijaabada ama u hagaajiyaan tijaabada.Kadibna natiijooyinka tijaabada ah ee habkan lagu helay waxaa ka buuxa macluumaad, tayo sare leh, oo la isticmaali karo.

MIBBI -http://www.mibbi.org) soo baxay.MIBBI waa mashruuc bixisa halbeegyada tijaabooyinka.Waxaa lagu daabacay dabeecadda.Mashruucan waxaa loogu talagalay tijaabooyin kala duwan oo bayooloji ah, oo ay ku jiraan bayoolaji unug, Microarray, qPCR waanu ka hadli doonaa hadda, iwm., wuxuuna bixiyaa nooc kasta oo tijaabo ah marka la soo gudbinayo qoraal-gacmeedyo.Macluumaadkaas waa in la bixiyaa mar walba.

Mashruuca MIBBI, waxa jira laba maqaal oo la xidhiidha PCR tireed fluorescent, kuwaas oo kala ah:
RDML (Luqadda Calaamadaynta Xogta PCR-waqtiga-dhabta ah) – luuqad habaysan iyo hagaha warbixinta ee xogta PCR ee tirada dhabta ah;
·MIQE (Macluumaad ugu Yar ee Daabacaadda Tijaabooyinka PCR-da-Waqtiga-dhabta ah ee Tirooyinka) - macluumaadka ugu yar ee daabacaadda maqaallada ku saabsan tijaabooyinka PCR ee tirada dhabta ah.
Marka hore, aan ka hadalno RDML, qeexida erey-bixinta.

Haddii aysan jirin qeexitaan caadi ah oo wax walba ah, suurtagal maaha in la sii wado dooda, taas oo ah sababta sharaxaadda ereyada ay muhiim u tahay imtixaanka.
Eray bixinta loo isticmaalo tijaabada PCR ee tirooyinka fluorescent waxaa ka mid ah waxyaabaha soo socda.QIAGEN ayaa noo samaysay soo koobida ugu wanagsan.Kuwa soo socda dhamaantood waa qalalan yihiinalaab .

Qallooca weyneynta
Qalooca weyneynta waxaa loola jeedaa qalooca la sameeyay inta lagu guda jiro habka PCR, oo leh nambarka wareegga sida abcissa iyo xoojinta fluorescence ee waqtiga-dhabta ah inta lagu jiro falcelinta sida ordinate.

Qalooca cod-weyneyn heer sare ah waa inuu lahaadaa sifooyinka soo socda: gundhiggu waa fidsan yahay ama wax yar baa hoos u dhacay, mana jiro kor u kac muuqda;barta qalooca ee qalooca waa caddahay, iyo jiirada wejiga jibbaarada waxay la mid tahay waxtarka xoojinta.Mar kasta oo jiirada weyni ay sii korodho, waa ay sii kordheysaa waxtarka xoojinta;qalooca weyneynta guud Isbarbar yaaciisu waa wanaagsan yahay, taasoo muujineysa in waxtarka weyneynta tuubo kasta uu la mid yahay;wejiga jibbaarada ee qalooca kordhinta ee muunad-fiirsasho hoose waa caddahay.

Asal ahaan (saldhig)
Saldhiggu waa heerka dhawaaqa wareegga hore, sida caadiga ah waxaa lagu qiyaasaa inta u dhaxaysa wareegga 3aad iyo 15aad, sababtoo ah korodhka qiimaha fluorescence ee ay keentay alaabta kor u qaadida lama ogaan karo muddadan.Tirada wareegyada loo isticmaalo xisaabinta gunta gundhigga waa kala duwanaan kartaa waxaana laga yaabaa inay u baahdaan in la dhimo haddii tiro badan oo template ah la isticmaalo ama haddii heerka muujinta hidde-sidaha bartilmaameedku sarreeyo.

Dejinta xariiqda gundhigga waxay u baahan tahay daawashada xogta fluorescence ee qalooca kordhinta toosan.Saldhigga waxaa loo dejiyay si korriinka qalooca cod-weyneyntu uu ku bilaabmo lambar wareeg ah oo ka weyn lambarka sare ee wareegga saldhigga.Saldhigyada waxay u baahan yihiin in si gaar ah loo dejiyo taxanaha bartilmaameed kasta.Celceliska qiimayaasha fluorescence ee lagu ogaado wareegyada hore waxay u baahan yihiin in laga jaro qiyamka fluorescence ee laga helay alaabta la xoojiyay.Noocyadii ugu dambeeyay ee software-ka PCR-da-waqtiga dhabta ah waxay u oggolaanayaan hagaajin toos ah ee jaangooyooyinka asaasiga ah ee muunadaha gaarka ah.

Inta lagu jiro dhowrka wareeg ee ugu horreeya falcelinta-weynaynta PCR, calaamadda florescence wax badan iskama beddeleyso.Ku dhawaanshaha xariiq toosan waxaa loo yaqaan gundhig, laakiin haddii aan si dhow u eegno dhowrka wareeg ee ugu horreeya, waxaan aragnaa in gudaha gundhigga ay tahay waxa ka dhacaya sawirka hoose.

Asalkii hore waxaa loola jeedaa
qiimaha fluorescence ee aan gaarka ahayn ee falcelinta .Tusaale ahaan: daminta fluorescence oo aan waxtar lahayn;ama tiro badan oo ah qaab DNA-da laba-geesooban iyadoo ay ugu wacan tahay isticmaalka SYBR Cagaaran.Qaybaha asalka ah ee calaamadda waxaa xisaab ahaan meesha ka saaray software-ka PCR-da-waqtiga dhabta ah.

Digniinta wariyaha
Digniinta wariyaha waxa ay tilmaamaysaa calaamada fluorescent ee ay dhaliso SYBR Green ama baadhitaano gaar ah oo si toos ah u calaamadsan inta lagu jiro PCR-da-waqtiga dhabta ah.

Calaamadaha Suxufiga Caadiga ah (RN)
RN waxaa loola jeedaa xoogga fluorescence ee dheeha weriyaha oo ay u qaybsan tahay xoogga fluorescence ee dheeha tixraaca dadban ee lagu cabbiro wareeg kasta.

Midabka Tixraaca Dadban
Qaar ka mid ah PCR-yada-waqtiga dhabta ah,dheeha fluorescent ROX waxaa loo isticmaalaa tixraac gudaha ah si loo caadiyeeyo calaamada fluorescent.Waxay saxaysaa kala duwanaanshaha sababtoo ah dhuumaha aan saxda ahayn, booska wanaagsan, iyo isbeddellada fluorescence ee ku salaysan si fiican.

Heerka fluorescence (threshold)
ayaa la hagaajiyay oo ka sarreeya qiimaha asalka oo si weyn uga hooseeya qiimaha taagga ee qalooca cod-weyneysiinta.Waa in ay ku dhex jiiftaa gobolka toosan ee qalooca cod-weyneyn, taasoo ka dhigan tirada log-linear ee ogaanshaha PCR.Heerarka waa in lagu dejiyaa aragtida qalooca log-amplification si wejiga-log-linear ee PCR si fudud loo aqoonsan karo.Haddii ay jiraan hiddo-wadeyaal badan oo bartilmaameed ah PCR-da-waqtiga-dhabta ah, xadka waa in loo dejiyaa bartilmaameed kasta.Guud ahaan, calaamada fluorescence ee 15ka wareeg ee ugu horeeya ee falcelinta PCR waxaa loo isticmaalaa sidii calaamada asalka ah ee fluorescence, iyo heerka fluorescence waa 10 jeer ka weecashada caadiga ah ee calaamada fluorescence ee 3 ilaa 15 wareegyada PCR ee ugu horeeya, iyo xadka fluorescence ayaa lagu dejiyay wajiga PCRl amplency.Guud ahaan, qalab kastaa waxa uu leeyahay marinka fluorescence oo la dejiyay ka hor inta aan la isticmaalin.

Meesha meertada (CT) ama Barta Goynta (CP)
Wareega uu qalooca cod-weyneyntu ka gudbayo marinka (tusaale, barta ogaanshaha fluorescence uu aad u kordho).CT waxay noqon kartaa jajab waxaana la xisaabin karaa cadadka qaabka bilowga.Qiimaha CT-gu wuxuu u taagan yahay tirada wareegyada la soo maray marka calaamada fluorescent ee tuubo kasta oo falcelinta PCR ay gaadho xadka la dejiyay.Waxaa jira xiriir toosan oo u dhexeeya qiimaha CT-ga ee template kasta iyo logarithm ee lambarka koobiga bilowga ah ee template,sare u kaca nambarka koobiga ee bilowga ah, waa sii yaraanaya qiimaha CT-ga, iyo lidkeeda.Qalooca caadiga ah waxaa lagu samayn karaa iyadoo la isticmaalayo halbeeg leh nambarka koobiga bilawga ah ee la yaqaan, halkaas oo abcissa ay u taagan tahay qiimaha CT, iyo ordinate waxay u taagan tahay logarithm nambarka koobiga bilowga ah.Sidaa darteed, ilaa inta qiimaha CT-ga ee muunada aan la garanayn, lambarka koobiga bilowga ah ee muunada waxaa laga xisaabin karaa qalooca caadiga ah.

Qiimaha ΔCT
Qiimaha ΔCT ayaa qeexayaFarqiga u dhexeeya hidde-sidaha la beegsanayo iyo qiimaha hidde-sidaha CT ee u dhigma, sida hiddo-wadaha guriga, waxaana loo isticmaalaa in lagu caadiyeeyo cadadka template ee la isticmaalay:
⇒ΔCT = CT ( hiddo-wadaha bartilmaameedka ) - CT ( hiddo-wadaha tixraaca endogenous )

Qiimaha ΔΔCT
Qiimaha ΔΔCT wuxuu qeexayaa faraqa u dhexeeya celceliska ΔΔCT ee muunadda xiisaha (tusaale, unugyada la kiciyey) iyo celceliska ΔΔCT ee muunadda tixraaca (tusaale, unugyo aan kicin).Muunadda tixraaca waxa kale oo loo yaqaan muunad is-xakamaynta oo dhammaan shay-baarada kale waa caadi tan marka loo eego qiyaas ahaan:
⇒ΔΔCT = celceliska ΔCT (muunada xiisaha) - celceliska ΔCT (muunada tixraaca)

Hiddo-sidaha tixraaca endogenous
Heerarka muujinta hiddo-wadaha tixraaca endogenous, sida hiddo-wadaha ilaalinta guriga ( hiddo-wadaha guriga), kuma kala duwana muunadaha.Isbarbardhigga qiyamka CT-ga ee hiddo-wadaha tixraaca hidde-sidaha bartilmaameedka ayaa u oggolaanaya heerka muujinta hidde-sidaha bartilmaameedka in lagu beddelo qaddarka gelinta RNA ama cDNA (eeg qaybta qiimayaasha ΔCT ee kor ku xusan).

Hiddo-wadeyaasha tixraaca gudaha ayaa sax ahBurburinta RNA ee suurtogalka ah ama joogitaanka enzyme-ka-horyaalka ee muunadaha RNA, iyo sidoo kale kala duwanaanshaha nuxurka RNA, waxtarka qoraalka rogaal celinta, soo kabashada acid nucleic, iyo muunad maaraynta muunada.Si loo doorto hiddo-wadaha tixraaca ee ugu wanaagsan, waxaanu wax ka beddelnay algorithmamka si aan u oggolaanno doorashada tixraaca ugu habboon ee ku xiran goobta tijaabada ah.

Xakamaynta gudaha
Taxane kontorool ah oo lagu xoojiyey fal-celin la mid ah tixda bartilmaameedka oo lagu baadho baaritaan ka duwan (tusaale ahaan, samaynta PCR-ga laba-laaban).Koontaroolada gudaha ayaa inta badan loo adeegsadaa si meesha looga saaro cod-weyneyayaasha guul-darraystay, sida marka aan la ogaan habka la beegsanayo.
Tusaalaha Habaynta
Muunad tixraaceed (tusaale, RNA la safeeyey oo laga keenay xariiqda unugga ama unugga) loo isticmaalo qiyaas ahaan si loo barbardhigo dhammaan shaybaarrada kale si loo go'aamiyo heerka muujinta qaraabada ee hidda-wadaha.Muunadda wax-soo-saarka waxay noqon kartaa muunad kasta, laakiin badanaa waa kontorool (tusaale ahaan, muunad aan la daweyn ama muunad laga soo qaatay wakhtiga eber ee tijaabada).

Xakamaynta togan
isticmaal falcelinta xakamayntaxaddi la yaqaan ee template.Koontaroolada togan ayaa inta badan loo isticmaalaa si loo hubiyo in qalabka aasaasiga ah ama qalab-baaritaanku si sax ah u shaqeynayo iyo in falcelinta si sax ah loo dejiyay.

Ma jiro Control Template (NTC)
Dareen-celinta xakamaynta oo ka kooban dhammaan qaybaha lagama maarmaanka ah ee falcelinta xoojinta marka laga reebo qaabka, kaas oo badanaa lagu beddelo biyo.Isticmaalka NTC waxay heli kartaa wasakhda ay keento wasakhowga reagent ama DNA shisheeye, sidaas darteed hubinta runnimada iyo isku halaynta xogta ogaanshaha.Kordhinta xakamaynta NTC waxay muujinaysaa faddarayn.

Ma jiro xakameyn RT (NRT)
Habka soo saarista RNA waxa ku jiri kara DNA genomic ah oo hadhaaga ah, kaas oo ah mid aad u dhib badan oo ah dambiilaha saameeya tayada xogta iyo cadawga dabiiciga ah ee qPCR, marka marka la naqshadeynayo tijaabooyinka, waa in loo qaabeeyey si loo kordhiyo ogaanshaha RNA.Waxaa jira laba siyaabood, mid waa in la naqshadeeyo asaasiga gudaha gudaha, tan kale waa in gebi ahaanba laga saaro DNA-da, midkee ka fiican, kaas oo laga hadli doono mar dambe.Xakamaynta NTR waa muraayad sixir lagu ogaado wasakhowga DNA-da.Haddii ay jirto cod-weyneyn, waxay la macno tahay in ay jirto wasakh.

Heerarka
Heerarka waa muunado ka mid ah fiirsashada la yaqaan ama nambar nuqul oo loo isticmaalo in lagu dhiso qalooca caadiga ah.Si loo hubiyo xasiloonida heerka, jajabka hiddasidaha waxaa badanaa lagu xiraa plasmid waxaana loo isticmaalaa heerka caadiga ah.

Qallooca caadiga ah
inta badan waxaa lagu qasi karaa ugu yaraan 5 gradients oo leh badeecada caadiga ah iyadoo loo eegayo saamiga labanlaabmay, iyo 5 dhibcood ayaa lagu sawiray isku-duwayaasha qiimaha CT iyo nambarka koobiga, dhibcaha waxay ku xiran yihiin inay sameeyaan xariiq si ay u dhaliyaan qalooca caadiga ah.Qalooca caadiga ah kasta, ansaxnimadiisa wuxuu u baahan yahay in la hubiyo.Qiimaha jiirada wuxuu u dhexeeyaa -3.3 iyo -3.8, iyo uruurinta kasta waxaa lagu sameeyaa saddex jeer.Qodobbada si weyn uga duwan qodobada kale waa in la tuuraa.Qiimaha CT-ga ee muunadda la tijaabinayo waxa la keenayaa qalooca caadiga ah, waxaana la xisaabin karaa heerka muujinta muunadda la tijaabinayo.

Qiimaha CT-ga ee muunadda la tijaabinayo waxa la keenayaa qalooca caadiga ah, oo nambarka koobiga ee muunadda la tijaabinayo waa la xisaabin karaa.

Waxtarka iyo Jiirada
Jiirada qalooca caadiga ah waxay u taagan tahay waxtarka waqtiga-dhabta ah PCR.
Jiirada -3.322 waxay muujinaysaa in waxtarka kordhinta PCR uu yahay 1, ama 100% hufan, iyo qadarka alaabta PCR labanlaabanto wareeg kasta.
Jiirada ka yar -3.322 (tusaale, -3.8) waxay tusinaysaa waxtarka PCR
Jiirada ka weyn -3.322 (tusaale, -3.0) waxay tusinaysaa in waxtarka PCR u muuqdo inuu ka weyn yahay 100%, taas oo cajiib ah, sidee hal wareeg oo PCR ah u dhalin karaa wax ka badan labanlaab alaabta la xoojiyay?Xaaladdani waxay ku dhacdaa marxaladda aan tooska ahayn ee falcelinta PCR, taas oo ah, waxaa jira xaddi badan oo weyn oo aan gaar ahayn.

qalooca dhalaalaysa
Ka dib markii qPCR la dhammeeyo, alaabta PCR waa la kululeeyaa.Marka heerkulku kor u kaco, badeecada labajibbaaran ee labajibbaaran ayaa si tartiib tartiib ah u dhalaali doonta, taasoo keentay hoos u dhac ku yimaada xoojinta fluorescence.Marka heerkul gaar ah (Tm) la gaaro, tiro badan oo alaab ah ayaa dhalaali doona.Fluorescence ayaa si aad ah hoos ugu dhacaya.Alaabooyinka kala duwan ee PCR waxay leeyihiin qiimayaal Tm oo kala duwan iyo heerkul dhalaal oo kala duwan, si gaar ahaan PCR loo aqoonsan karo.

Qalooca dhalaalaysa (qallooca kala soocida)
Qalooca dhalaalka waxaa loo soo saaray si uu u sameeyo khariidad ugu sarreysa, kaas oo si dareen leh u muujin kara xaaladda jajabyada alaabta PCR.Maadaama heerkulka dhalaalku yahay qiimaha Tm ee jajabka DNA-da, qaar ka mid ah xuduudaha saameeya qiimaha Tm ee jajabka DNA waa la xukumi karaa, sida xajmiga jajabka, nuxurka GC, iwm. Guud ahaan, marka loo eego mabaadi'da naqshadeynta asaasiga ah,Dhererka badeecada la xoojiyey waxay u dhaxaysaa 80-300bp, markaa heerkulka dhalaalku waa inuu u dhexeeyaa 80 ° C iyo 90 ° C.

Fasiraadda qalooca dhalaalka: Haddii ugu sarreysa kaliya ee ugu weyn ay u muuqato inta u dhaxaysa 80 ° C-90 ° C, waxay la macno tahay in PCR-ga tirooyinka fluorescent uu yahay mid qumman;Haddii heerka ugu sarreeya ee ugu sarreeya uu u dhexeeyo 80 ° C-90 ° C oo ay ka soo baxaan meelo kala duwan oo ka hooseeya 80 ° C, dimer-ka aasaasiga ah ayaa asal ahaan la tixgeliyaa.Waxaad isku dayi kartaa inaad kordhiso heerkulka jilitaanka si aad u xalliso;Haddii heerka ugu sarreeya uu u dhexeeyo 80 ° C-90 ° C, iyo ugu sarreeya ee kala duwan ayaa soo muuqda mar kale marka heerkulku kordho, asal ahaan waxaa loo tixgeliyaa in ay jirto wasakh DNA, DNA-da waxay u baahan tahay in la saaro marxaladda hore ee tijaabada.

Dabcan, weli waxaa jira xaalado aan caadi ahayn, kuwaas oo mid mid hoos loo kala qaadi doono.
3. Aqoon sare

Si loo sameeyo qPCR, waa inaan dhahaa MIQE,Xogta Ugu Yarloogu talagalay DaabacaaddaTiradaPCR-waqtiga dhabta ahTijaabooyinka -macluumaadka ugu yar ee daabacaadda maqaallada ku saabsan PCR-waqtiga dhabta ahtijaabooyin .Si loo fududeeyo qof walba fahamkiisa, waxaanu fududayn doonaa nuxurka muhiimka ah.

Waxaad ka raadin kartaa qoraalka asalka ah ee MIQE ee internetka, iyo waxa ugu muhiimsan waa in uu qeexayoliiska hubinta xogta ee u baahan in la bixiyo marka maqaal la daabacayo .

Dib-u-eegayaashu waxay xukumi karaan tayada tijaabada iyagoo akhrinaya faahfaahintan;Akhristayaasha mustaqbalka waxay sidoo kale u isticmaali karaan tan si ay ugu celiyaan ama u hagaajiyaan tijaabada.
Waxaa xusid mudan in liiskan, muhiimada liis kasta lagu calaamadeeyay E ama D siday u kala horreeyaan.Waxa loola jeedaa?E: macluumaadka muhiimka ah (waa in la soo gudbiyaa);D: macluumaadka la rabo (bixi inta ugu badan ee suurtogalka ah).

MIQE (1) — Naqshad Tijaabo
Qaar badan oo qallafsan oo dhameystay difaacooda ka dib markay dhammeeyaan waxbarashadooda qalin-jabinta ma garanayaan sida loo naqshadeeyo tijaabada si madax-bannaan, u furaan buug-yaraha, oo ay sameeyaan waxa macalinku u sheego inay sameeyaan.Sidaa darteed, naqshadda tijaabada ah ma ahayn mid adag, oo waaxda tifaftirka ee majaladda ayaa sheegtay in ay doonayaan in ay sameeyaan sawirkan iyo sawirkaas, sidaas darteedna ay u sameeyeen iyaga oo dawakhsan.Sidan ayaa loo sameeyay qashinka!

U dhow guriga, mabda'a ugu horreeya ee tijaabada ayaa ah in la go'aamiyoadkaanta macquulnimada tijaabada ah.Waxa ugu aasaasiga ah waa naqshadaynta tijaabada, iyo waxa ugu muhiimsan ee naqshadaynta tijaabada ah waa sida loo dejiyo muunada bartilmaameedka, muunada tixraaca (control), iyo tirada soo noqnoqda, si xogta tijaabada ah loo tixraaco, la barbar dhigo, loona qanciyo.

Muunada bartilmaameedka ahWaxa loola jeedaa muunadda nooga baahan inaan ogaano hidda-sidaha la beegsanayo daawaynta qaarkood ka dib.Tusaalaha tixraacawaa muunada iyada oo aan lahayn wax daaweyn ah, taas oo inta badan loo tixraaco nooca duurjoogta ah ee bayoolaji.

Ku celcelinta tijaabada ahaad bay muhiim u yihiin.Guud ahaan, tirada ku celcelinta qancisa waa in ay ka badan tahay saddex.Waxaa lagama maarmaan ah in la kala saaro waxa ay tahay taranka noolaha iyo waxa farsamo-ku-celinta.

Ku-noqoshada Nafleyda: Tijaabo isku mid ah oo hubin ah oo lagu sameeyay walxo kala duwan (waqti, dhir, dufcad, taargooyin falcelin ah).

nuqul ka mid ah noolaha
Aynu tusaale u soo qaadanno daawaynta sunta basbaaska.Waxaan rabnaa inaan ku buufinno sunta cayayaanka saddexda geed ee ABC, ka dib saddexda dhir ee ABC waa seddex nuqul oo noole ah, waana tijaabo isku mid ah oo xaqiijin ah oo lagu sameeyay walxo kala duwan.Laakiin tijaabo ahaan, xakamaynta ayaa hubaal ah loo baahan yahay, markaa waxaan ku buufin karnaa mid ka mid ah laamaha geedka A si aan u samayno koox tijaabo ah oo geedka A ah, oo aan ku buufin laamaha kale ee dhirta A si loo sameeyo koox xakameyn.Si la mid ah u samee B iyo C.

Ku celcelinta Farsamada (Farsamo ku celcelinta): Waa tijaabo soo noq-noqotay oo loogu talagalay in laga fogaado khaladaadka ka dhasha qalliinka, kaas oo dhab ahaantii ah dalool nuqul ah oo ku jira isla walxo isku mid ah.Labada daawaynta iyo kantaroolayaashuba waa inay lahaadaan goobo soo noqnoqda (saddexda ugu yar) ee hiddo-wadaha bartilmaameedka ah iyo hiddaha tixraaca gudaha.

Ku celcelinta farsamada
U soo qaado basbaaska lagu daweeyay sunta cayayaanka sida tusaale ahaan mar kale.Kooxda tijaabada ah ee dhirta A, waxaanu samaynay saddex godood oo PCR ah oo ah 1, 2, iyo 3 ee hiddo-wadaha bartilmaameedka ah iyo hiddaha tixraaca gudaha siday u kala horreeyaan, si loo qaato celceliska ka dib ogaanshaha.Xakamaynta dhirta A Kooxaha sidoo kale waxaa loola dhaqmaa si la mid ah.Sidoo kale, u samee daweyn isku mid ah dhirta B iyo C.Tani waa ku celcelin farsamo.

Waxaa xusid mudan taaswaxa gala tirakoobka waa ku celcelinta noolaha, ku celcelinta farsamaduna waa in la tijaabiyo in ay jiraan wax ifafaale ah oo aan kala sooc lahayn oo ku jira habka tijaabada, si natiijada tijaabada looga dhigo mid la aamini karo, taas oo ah, in laga fogaado khaladaadka iyada oo la qaadanayo celceliskooda sida aynu inta badan nidhaahno.

Xakamaynta xun-NTC iyo NRT
NTC (Control-la'aan-Template), kantarool aan lahayn qaab-dhismeedka, ayaa loo isticmaalaa si loo xaqiijiyo in walxaha tijaabada ah ay wasakhoobeen.Guud ahaan, biyaha waxaa loo isticmaalaa qaab tusaale ahaan.Haddii ay jirto fal-celin fluorescent, waxay muujinaysaa in wasakheynta aashitada nucleic ay ka dhacday shaybaarka.

Wasakhowgani waxay ka yimaadaan: biyo aan nadiif ahayn, reagen aan u qalmin oo ka kooban DNA endogenous, wasakhowga asaasiga ah, wasakhowga qalabka shaybaadhka, wasakhowga hawada, iwm., waxay u baahan yihiin isticmaalka qashinka RNase iyo horjoogayaasha RNase.Wasakhowga hawada ayaa ah tan ugu adag in la helo.Bal qiyaas shaybaadhkaagu inuu la mid yahay qiiqa, oo leh asiidhyo nucleic ah oo kala duwan oo hawada ku jira.

NRT (Transcriptase-ka-noqosho lahayn), kantaroolka oo aan lahayn qoraal-ku-noqosho, waa RNA-ga aan-ka-soo-noqo lahayn ee la-qoray sida kantarool xun, kaas oo ah xakamaynta hadhaaga gDNA.

Marka la samaynayo muujinta hidda-wadaha, qaddarka RNA waxaa lagu ogaadaa iyadoo la ogaanayo qaddarka cDNA ka dib qoritaanka rogaal celinta.Haddii ay jirto hadhaaga gDNA marka RNA la nadiifiyo, waxay keeni doontaa khaladaad natiijooyinka tijaabada ah, sababtoo ah natiijooyinka dhabta ah ee la helay waa gDNA iyo cDNA.Marka la eego heerka wadarta guud, ma aha oo kaliya cDNA, gDNA waxay u baahan tahay in si buuxda loo saaro inta lagu jiro soo saarista RNA.

MIQE (2) — tusaale ahaan macluumaadka
Waxa loogu yeero macluumaadka muunada micnaheedu waa marka aan daabacno maqaal ku saabsan qPCR, waa inaan si cad u sharaxnaa macluumaadka muunada, taas oo ah qayb lagama maarmaan ah oo maqaalka ah.Sidoo kale, marka aan samayno muunado, waa in aan sidoo kale nidaamino hawlgaladayada si aan u hubinno saxnaanta shaybaarada.

Sharaxaada muunada waa natiijo kaliya, waana in aan fiiro gaar ah u yeelanaa agabka la qaatay intii lagu jiray tijaabada oo dhan.

Doorashada qalabka tijaabada ah
Muundooyinka dhiigga - dooro dhiig cusub, wax aan ka badnayn 4 saacadood.Muunadaha unugyada - dooro inaad ururiso unugyo cusub muddo koritaan xooggan ah.Nudaha Xoolaha—dooro unug cusub oo si xoog leh u koraya.Nudaha dhirta - Dooro unug cusub oo yaryar.

Waa inaad dareentay inuu kelmad muhiim ah ku jiro dhawrkan jumladood: cusub .
Shaybaarada kore, xirmada ugu fiican, ugu waxtarka badan, iyo xirmada xasiloon ee suuqa waa xirmada Foregene, kaas oo si deg deg ah oo fudud u soo saari kara DNA-da iyo RNA.

Qalabka yar ee DNA-ga

Qalabka Go'doominta unugga ee RNA

Wadarta Xayawaanka Qalabka Go'doonka RNA

Qalabka Go'doominta RNA Wadarta Dhirta

Qalabka Go'doominta Dhirta ee RNA Plus

Qalabka Go'doominta DNA-da

Kaydinta alaabta tijaabada ah
Guud ahaan, kuma talineyno in la keydiyo shaybaarada, haddii shuruuduhu oggolaadaan.Si kastaba ha ahaatee, waxaa jira saaxiibo badan oo aan samayn karin tijaabooyin isla markiiba ka dib muunad, iyo qaar xitaa waxay u baahan yihiin inay qaadaan taangiyada nitrogen ee dareeraha ah garoonka si ay muunad u qaataan.

Saaxiibka shaqada adag ee noocan ah, waxa aan odhan karaa oo kaliya ma fahmin waxyaalaha la isticmaalo ee reagents.Hadda shirkado badan oo la isticmaali karo ayaa soo saara reagen kuwaas oo ku kaydin kara shaybaarka RNA heerkulka qolka, waxaadna dooran kartaa inaad isticmaasho.Habka kaydinta caadiga ah waa kaydinta nitrogen dareere ah, iyadoo la isticmaalayo haan yar oo nitrogen dareere ah oo ay fududahay in la qaado.Ka dib markaad muunada ku soo celiso shaybaadhka, ku kaydi qaboojiyaha -80°C.

Tijaabooyinka ku lug leh RNA, mabda'a lixda kelmadood waa in la raaco:heerkulka hooseeya, ma jiraan enzymes,iyodegdeg ah .

Fikradda heerkulka hooseeya waa sahlan tahay in la fahmo;enzymes la'aanteed, RNase waa meel kasta oo adduunka ah oo aan ku noolnahay (haddii kale waxaa lagu dili lahaa HIV), markaa sida looga fogaado RNase marka la samaynayo tijaabooyinka waa fikrad aad muhiim u ah;degdeg ah,Ma jiro Kung Fu adduunka oo aan la jabin karin, kaliya xawaaraha lama jabin karo.

Sidaa darteed, dareen ahaan, wakhtiga soo saarista oo gaaban, ayaa ka sii fiican xirmada.Waa maxay sababtaForegeneQalabka wuxuu xoojiyaa xawaaraha, sababtoo ah si fiican ayay u garanayaan.

PS: Gabdhaha qaarkood si taxadar leh ayey u tijaabiyaan, laakiin uma fiicna sida dunk-slam dunk ka dib dhowr sano oo shaqo ah.Waxay dareemeen in Ilaah xaqdarro yahay, oo dadka kale ka cabanayo, oo nolol raadinaya.Runtii ma ay fahmin.Isagu si fiican uma ilaalin RNA-ga, ciyaartoyga slam dunk-na waxa uu ahaa mid jilicsan.Markii uu tijaabinayey waxa uu is yidhi saddex jeer, shan jeer iyo laba qaybood ayuu ku dhammeeyaa, laakiin si fiican buu tijaabada u sameeyey.

Ogow: tartiib tartiib ah, fursado badan oo duulaanka RNase.Sidee loo tababaraa naftaada si aad u dhaqso badan?Ma jirto waddo, kaliya ku celceli wax badan.

Tijaabooyin kala duwan iyo muunado kala duwan, weli waa lagama maarmaan in la akhriyo suugaan badan oo la doorto hab ku habboon habraaca.Habka ururinta muunada iyo kaydinta, MIQE waxay u baahan tahay in si cad loogu qoro warqadda, si ay dib-u-eegayaashu u eegaan kalsoonida warqadda, iyo sidoo kale waxay ku habboon tahay dhalinyarada yaaban inay ku celiyaan tijaabadaada.

Inkasta oo tijaabooyinka bayoolojigu ay adag yihiin, haddana waa kuwo heersare ah.Haddii aadan ka taxaddarin, waad rogi kartaa adduunka.Tusaale ahaan, ka dhigista SARS qalalaasaha biochemical, ama samaynta bariiska isku-dhafka ah si loo badbaadiyo 1.3 bilyan oo qof.Sawirka hoose waa tijaabo kiimiko, waa inaad fahamtaa sida aad ugu hanweyn tahay cilmi-baaristaada kaliya adoo eegaya muuqaalkiisa u eg dick.Iska ilow, ha u madoobin isaga.

MIQE (3) - soo saarista aashitada nucleic.
Soo saarista aashitada nukliyeerka waa dhacdo weyn, dhammaan tijaabooyinka bayooloojiyada molecular waxay ka bilaabmaan soo saarista aashitada nucleic.Marka hore, aan koobiyno nuxurka MIQE ee soo saarista aashitada nucleic.

Markaad eegto foomkan, ma joogi kartid dusha sare.Qaabku waa dogma.Si aad u noqoto arday sare, waa inaad waydiisaa sababta.Nuxurka lama huraanka ah ee shaxdani waa: Raacsodaahirnimada, daacadnimada, joogtaynta, iyo soo saarista cadadka RNA .

Qaybta hore eehabka ama qalabku waa tallaabada soo saarista aashitada nucleic.Haddii aad isticmaasho soosaaraha aashitada nukliyeerka ee tooska ah si aad u soo saartid (horumarsan, fadlan ila soo xiriir si aan u iibsado), waxaad u baahan tahay inaad muujiso magaca qaabka qalabka.

Magaca qalabka iyo

xirmada loo isticmaalay tafaasiisha isbeddelka, waxa reagen-yaasha gaarka ah ee lagu daray ama hawlgallada gaarka ah ee la sameeyay waa in si cad loo sharaxaa si kuwa kale ay si fudud ugu soo celin karaan tijaabadaada.

Dadka qaarkiis waxay ku daraan reagen gaar ah marka ay soo saarayaan muunado gaar ah, iyagoo u malaynaya in kani yahay hubkooda sirta ah oo ha u sheegin kuwa kale.Iyagoo sir qarinaya, waxay sidoo kale luminayaan fursadda ay maqaalkaaga uga dhigi lahaayeen mid iftiimaya.Ha noqon mid xariif ah, waa inaad ka daacad badan tahay waddanka Zhang ee cilmi-baarista sayniska, haddii aad rabto inaad noqoto mid xariif ah, maqaalku wuxuu kaa dhigi doonaa nacas.

waa in la xusuustaa lambarka alaabta ee xirmadamarka aad dalbato xirmada oo aad qorto maqaalka .Guud ahaan waxaa jira laba lambar oo ku jira xirmada: Cat-nambarka (lambarka badeecada, lambarka maqaalka), Lot-nambarka alaabada (loo isticmaalo in lagu tilmaamo dufcada alaabtu ka timid).

Intaa waxaa dheer, lambarka CAS waxaa badanaa la isticmaalaa marka la dalbanayo reagents biochemical, oo aan si wadajir ah u faafin doono.Lambarka CAS waa lambarka ay siisay Ururka Kiimikada Mareykanka ee dawo kasta oo cusub.Guud ahaan, saddex nambar ayaa lagu xidhaa xariijin.Rushui's CAS nambarka: 7732-18-5.Kiimikada badanaa waxay leeyihiin magacyo badan, laakiin lambarka CAS waa mid gaar ah.Markaad dalbanayso daawada, waxaad marka hore hubin kartaa nambarkeeda CAS.

U dhow guriga, maxay tahay inaan waxyaalahan si cad u qeexno?Dhab ahaantii, sidoo kale waa in la hubiyo tayada soo saarista RNA.Isticmaalka qalabka iyo xirmooyinka ayaa ka dhigi doona soo saarista RNA mid joogto ah.Miisaanka soo saarista shaybaarada caadiga ah ma badna, waxaana lagu heli karaa qalabyo.

Faahfaahinta daawaynta DNA-ga ama RNase
Arrinka muhiimka ah ee PCR-ga tirada badan ee fluorescent waa in laga hortago wasakhowga DNA-da, hana tijaabin haddii ay jirto wasakh.Sidaa darteed, waxaa lama huraan ah in la sheego habka aad u isticmaashay in aad DNA-ga ka baarto, si aad u muujiso in DNA-da habka tijaabada ah si buuxda oo gebi ahaanba meesha looga saaray.oo lagu matalayo jaantuska jaantuska.

Jaantuska shaxanka ee RNA iyo DNA
Guud ahaan, habka looga saaro DNA waa in RNA lagu daweeyo DNA-da ka dib marka la soo saaro.Si kastaba ha ahaatee, kuwani waa habab hore.Xirmooyinka soo saarista RNA ee ganacsiga ayaa awooday in ay ka saaraan DNA-da inta lagu jiro habka soo saarista iyada oo aan lagu darin DNA-da.Tusaale ahaan, xirmo taxane ah oo ka yimid Foregene.

Ogow: Ka saarida DNA-da inta lagu jiro soo saarista RNA waa seef laba af leh oo aad khatar u ah, taas oo dheerayn doonta wakhtiga hawlgalka ee soo saarista RNA korna u qaadi doonta khatarta hoos u dhigista RNA.Asal ahaan, waa ka-ganacsi u dhexeeya dhalidda RNA iyo nadiifnimada.

Intaa waxaa dheer, qadarka DNA-ga lagu daray tiirka xayeysiiska ee silica-ku-salaysan aad ayuu u yar yahay, iyo tayada sare ee DNase waa in la isticmaalo si loo gaaro saamaynta.DNase aan la hagaajin si dhakhso ah oo dhammaystiran looma dheefi karo.Tani waa tijaabada heerka farsamada ee ganacsadaha.Dabcan, waxaa jira xitaa ganacsato yaab leh oo ku faanaya in DNA laga saari karo DNA la'aan.Waxa la odhan karaa qof kasta oo ku faana in DNA-da gebi ahaanba laga saari karo DNA la’aanteed waa hooligan.DNA-du waa qaab-dhismeed laba-geesood ah oo deggan, lamana tirtiri karo hadal iyo qosol keliya.

Qiimaynta faddaraynta
Habka qiimaynta: ogaanshaha electrophoresis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, loading 1-3 ul

Falanqaynta tirada acid nucleic
inta badan waxa lagu cabbiraa iyadoo la isticmaalayo spectrophotometer UV.Aan marka hore shaaciyo macnaha saddexda qiyam ee OD260, OD280, iyo OD230.
·OD260nm: Waa dhererka mowjadda nuugista ee ugu sarreysa nuugista nukleic acid, iyo qiimaha ugu fiican ee la cabbiray wuxuu u dhexeeyaa 0.1 ilaa 1.0.Haddii kale, milo ama xooga saar muunadda si aad u keento inta u dhaxaysa.
OD280nm: Waa dhererka mowjadda nuugista ee ugu sarreysa nuugista borotiinka iyo walxaha phenolic.
·OD230nm: Waa dhererka mowjadda nuugista ee ugu sarreeya nuugista karbohaydraytyada.

Marka xigta, aan ka hadalno doorka tilmaame kasta.A260, waxaa loo isticmaali karaa in lagu cabbiro dhalidda nucleic acid.Marka OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Nadiifinta, waxaan u baahanahay inaan eegno saamiga aan caadi ahaan aragno: OD260/280 iyo OD260/230.
DNA saafi ah: OD260/280 waxay la mid tahay 1.8.Marka ay ka weyn tahay 1.9, waxay muujinaysaa inay jirto wasakhowga RNA, iyo marka ay ka yar tahay 1.6, waxay muujinaysaa inay jiraan borotiin iyo phenol wasakh ah.
· RNA saafi ah: 1.7
· OD260/230: Haddi ay tahay DNA ama RNA, qiimaha tixraacu waa 2.5.Marka ay ka yar tahay 2.0, waxay muujinaysaa inay jirto wasakhowga sonkorta, milixda iyo walxaha organic.

daacadnimada RNA

Aad bay muhiim u tahay in la cabbiro daacadnimada RNA.Guud ahaan, waxaa lagama maarmaan ah in la sameeyo tijaabo jel denaturation RNA si loo hubiyo in dhalaalka u dhexeeya 28S iyo 18S RNA uu yahay xidhiidh laba laab ah.Marka qaybta saddexaad ee 5S ay soo baxdo, waxay la macno tahay in RNA uu bilaabay inuu hoos u dhaco, marka laga reebo kuwa laf-dhabarka ah.

Xogta qiimaynta tayada RNA: Marka lagu daro imtixaanada kor ku xusan, waxa kale oo jira qaar ka mid ah tijaabooyinka qalabka oo aad u horumaray marka la eego daacadnimada RNA, sida tijaabada daacadnimada RQI ee nidaamka elektrophoresis ee otomaatiga ah, kaas oo ogaan kara in RNA ay hoos u dhacday si aan muuqan.

Cilmi-baarista sayniska, PCR-ga tireed ee fluorescent waa isbarbardhigga u dhexeeya hidda-wadaha bartilmaameedka ah iyo hiddaha tixraaca gudaha.Sidaa darteed, habka ilaalinta muunadda RNA, soo saarista RNA, iwm., hadafka koowaad waa in la hubiyo daacadnimada RNA.

Sida daacadnimada RNA ay u saamayso dheelitirka u dhexeeya hidda-wadaha bartilmaameedka ah iyo hiddaha tixraaca gudaha ayaa si fudud looga fahmi karaa shaxanka hoose.Hoosudhacdu waxay u horseedi doontaa dhamaystir la'aanta hidda-wadaha, haddii ay tahay dhammaystir-la'aanta hidde-wadaha tixraaca gudaha ama dhamaystir-la'aanta hidde-sidaha bartilmaameedka, waxay saameyn weyn ku yeelan doontaa xogta.

jaantuska jaantuska hidda-sidaha bartilmaameedka iyo hidde-sidaha tixraaca, waa in aanu run noqon

Tijaabada xannibaadda (haddii qiimaha CT lagu xakameynayo feejignaan sare ama hoose ama xaalado kale)

Haddaan tusaale ahaan u soo qaadanno jaantuskan, qiyamka Ct ee shanta qaloocood waa sidan soo socota.Qaybinta qiyamka CT-ga ee udhaxeeya qaloocadu waa mid aan sinnayn, qiyamka Ct-na waxa uu dib u dhigayaa marka la eego xaddi sare iyo mid hoose, taas oo ah kiiska xannibaadda PCR.

Qodobka muhiimka ah: Habka soo saarista RNA, waxaan u baahanahay inaan ka tagno fikradaha khaldan oo aan aasaasno kuwa saxda ah.

Fikradda khaldan waa: soo saarista RNA kaliya waxay raacdaa wax-soo-saarka, iyada oo u maleynaysa in tirada weyn ee RNA ee la helay, ay ka sii fiicnaan doonto.Dhab ahaantii, marka aan samayno qiyaasid, haddii tirada hidde-sideyaasha aysan aad u badneyn, uma baahnid RNA badan.Qadarka RNA ee aad soo saartay ayaa ka badan ku filan .

Fikradda saxda ah waa:Soo saarista RNA waa in ay raacdo daahirnimada, daacadnimada iyo joogtaynta.Nadiiftu waxay xaqiijin kartaa in qoraalka gadaale ee xiga aan la xannibin xogtana ma saameyn doonto DNA-da.Daacadnimadu waxay hubisaa isku dheelitirnaanta taxanaha bartilmaameedka iyo tixraacyada gudaha.Joogteynta waxay xaqiijisaa rarida muunad deggan.

MIQE (4) - dib u qorista
Fikrad khaldan: raadinta mugga muunada sare.
Fikrad sax ahJoogteynta dabagalka (xasiloonida), iyadoon loo eegin tirada RNA raran tahay, hufnaanta qoraalka gadaasha ayaa ah mid joogto ah, iyadoo la hubinayo in kala duwanaanshaha cDNA ay si dhab ah u muujin karto kala duwanaanshaha mRNA.
Waxaan habkan ku sharaxnay jaantus shax:

Jaantuska jaantuska ee hufnaanta qoraalka gadaal, run ha noqon
Ugu horreyntii, waxaan u baahannahay inaan fahamno farqiga u dhexeeya habka qoraalka qoraalka iyo habka PCR.PCR waxa ay martaa habab badan oo kulaylinta iyo soo saarista, iyo jajabka bartilmaameedku u korayo si xad dhaaf ah;halka qoraalka gadaasha uusan lahayn habkan, waxaan qiyaasi karnaa in qoraalka gadaasha ahi uu dhab ahaantii yahay mid-ka-mid ah Inta lagu jiro habka nuqulka, sida qaybo badan oo RNA ah.

maadaama ay jiraan in la heli karo inta qaybood ee xogta cDNA-da, waa in la fahmo hadda, sababtoo ah jajabyada waaweyn iyo kuwa yaryar ayaa dib loo kala qoray, suurtagalna maaha in hal jajab la saaro.Iyo sababta oo ah cadadka RNA waa mid yar, cadadka cDNA ee la helay sidoo kale waa yar yahay, si ka duwan PCR, kaas oo leh saameyn xoojin ah, sidaa darteed asal ahaan waa wax aan macquul aheyn in la ogaado.

Natiijooyinka electrophoresis cDNA
Marka labaad, sida ugu habboon, qoraal-ku-celinta ayaa loo sameeyaa hal-hal-hal, laakiin ma jiro qoraal-ku-noqosho ah oo shirkad kasta ka timid oo gaadhi karta saamayntan.Asal ahaan, hufnaanta inta badan qoraallada dib-u-celinta waxay u dhaxaysaa 30-50%.Haddii ay taasi dhacdo, waxaan doorbidi karnaa hufnaan qoraal ah oo xasilloon, taas oo ah waxa aan rabno inaan ku aragno shaxanka: 3 RNAs waxay helayaan 2 cDNAs, 6 RNAs waxay helayaan 4 cDNAs, si kasta oo muunada loo raro, waxtarka qoraalka gadaasha ayaa ah mid deggan.Ma rabno inaan aragno xaaladda ay waxtarka qoraal-ku-celinta ee rogaal-celinta ahi aanay degganayn oo xoog-ururinta sare la xannibay.

Haddaba, sidee loo xaqiijiyaa in waxtarka qoraalka gadaasha uu yahay mid deggan?Habka waa mid aad u fudud, kaliya waxaad u baahan tahay inaad sameyso tijaabada isbarbardhigga: mid waa inaad dib u celisaa ku qorista cDNA ka dib laba jibbaaritaanka RNA, midda kalena waa in la sameeyo laba jibbaar ka dib markii loo rogo cDNA, ka dibna samee qPCR si aad u aragto jiirada la helay ma joogto.Ardayga ugu sarreeya, waa inaad ku fahantaa ilbidhiqsiyo gudahood.Sida hoos ka muuqata:

Dilution of RNA iyo cDNA si loo tijaabiyo in waxtarka qoraalka gadaalku uu yahay mid degan
Dib u rogida qoraalka iyo xirmada
Sidee saxda ah ee tirooyinka fluorescent PCR u yeelan karaan qoraal-soo-celin heersare ah iyo xirmo.Qoraalka dib u celinta ayaa qiyaas ahaan loo qaybiyaa laba nooc iyadoo loo eegayo isha, AMV amaM-MLV, waxqabadkooduna wuxuu la mid yahay kan shaxda ku cad.

Hawlaha RNase H
RNase H waa Ribonuclease H, magaca Shiinaha waa ribonuclease H, kaas oo ah endoribonuclease kaas oo si gaar ah hydrolyze kara RNA ee silsiladda isku-dhafka DNA-RNA.RNase H ma dami karto curaarta fosfodiester-ka ee hal-xadhigleed ama laba-jibbaaran DNA ama RNA, taas oo ah, ma dheefi karto hal-xadhigleed ama laba-jibbaaran DNA ama RNA.Caadi ahaan loo isticmaalo isku dhafka qaybta labaad ee cDNA.

Waa arin yaab leh.Waxa aanu nidhi in transcriptase gadaalku leeyahay hawsha RNase H, ee ma aha in qoraalka qoraalka ahi ka kooban yahay RNase H, lagana yaabo in aanay suurtogal ahayn in la kala saaro RNase H iyo transcriptase kale, laga yaabee sababta oo ah u qaabaynta kooxo gaar ah

Sidaa darteed, iyada oo aan loo eegin waxtarka qoraalka gadaasha sare ee AMV, hawlaheeda RNase H waxa ay yaraynaysaa wax-soo-saarka cDNA.Dabcan, soosaarayaasha reagent waxay si joogto ah u wanaajiyaan alaabadooda si ay u baabi'iyaan dhaqdhaqaaqa RNase H ee qoraalka qoraalka ah intii suurtagal ah si loo kordhiyo dhalidda cDNA.
Heerkulka xajinta

Qaab dhismeedka labaad ee RNA heerkul kala duwan
Fiiri shaxanka sare qaab dhismeedka sare ee RNA heerkul kala duwan, oo isticmaal mFold aaladda khadka tooska ah si aad u go'aamiso qaab dhismeedka labaad ee jajabka bartilmaameedka ee hoos yimaada heerkulka gaarka ah iyo xaaladaha fiirsashada milixda.Marka la joogo 55°C, qaab dhismeedka sare ee RNA ayaa wali ah mid aad u adag, gadaashiina ma shaqayn karto, qaab dhismeedka sarena si buuxda looma xallin karo ilaa 65°C, halka heerkulka ugu fiican ee AMV iyo M-MLV uu aad uga hooseeyo heerkulkan.
maxaa la sameeyaa?Qaab dhismeedka labaad waa lamaanaynta dhamaystiran ee template laftiisa, taas oo keenta in tartan xoog leh u dhexeeya aasaasiga ah iyo qoraalka transcriptase iyo template, taasoo keentay in taxane ah dhibaatooyin sida E hoose iyo soo noqnoqda liidata.

maxaa la sameeyaa?Kaliya kordhi heerkulka wax-soo-saarka inta ugu badan ee suurtogalka ah.

Soosaarayaal badan oo reagent ah ayaa horumarinaya qoraalkooda dambe iyaga oo adeegsanaya injineernimada hidaha.Qaarkood waxay kordhiyaan heerkulka falcelinta, sida Jifan iyo Aidelai, qaarna waxay ka saaraan kooxda firfircoon ee enzyme-ka RNase H si loo hagaajiyo xidhiidhka ka dhexeeya enzyme-ka iyo template RNA.Xidhiidhka sare wuxuu si tartan ah u soo saari karaa qaab dhismeedka dugsiga sare oo wuxuu u akhrin karaa si habsami leh, iyo sidoo kale wuxuu si weyn u wanaajin karaa waxtarka qoraalka gadaasha.
Qodobka Muhiimka ah: Qoraalka dib u noqoshada ayaa aad muhiim u ah in la sii wado joogteynta hufnaanta qoraalka gadaasha (enzymes waa in aysan aheyn mid waxtar leh oo kaliya laakiin sidoo kale waa mid deggan), halkii ay ka ahaan lahayd cadadka muunada la raray, haddii aysan ahayn PCR-ga tirooyinka fluorescent-ka gaar ahaan ballaaran, suurtagal ma noqon doonto gabi ahaanba.CDNA-yo badan
Soosaarayaal kala duwan ayaa sidoo kale sameeyay xoogaa dadaal ah raadinta joogtada ah.Tusaale ahaan, shirkadaha intooda badani hadda waxay soo duubeen qoraal-ku-noqosho ahaan sidii qalab iib ah, taas oo ah doorasho wanaagsan.
Tusaale ahaan, qalabka 'Foregene's RT Easy Series' xirmooyinka:

RT Easy I (Master premix oo loogu talagalay xirmada isku dhafka cDNA ee ugu horreeya)

MIQE (5) - macluumaadka hidda-socodka ee bartilmaameedka ah

Sawirka sare ayaa sharaxaya
1. In hiddo-wadahani waxtar u leeyahay tijaabooyinka soo noqnoqda waxaa guud ahaan lagu xaqiijin karaa tijaabooyin soo noqnoqda.
2. Aqoonsiga hiddaha, waad ogtahay.
3. Dhererka hidda-wadaha, wadarta dhererka hidde-sidaha bartilmaameedku xaqiiqdii dhib ma laha.Markaad naqshadaynayso furayaasha, hubi in dhererka amplicon uu u dhexeeyo 80-200bp si loo hubiyo waxtarka cod-weyneysiinta.
4. Xogta isbarbardhigga qaraxa taxanaha ah, hiddo-wadaha bartilmaameedku waxa uu u baahan yahay in lagu barbar dhigo bangiga hidde-sideyaasha si looga hortago kordhinta aan gaarka ahayn.
5. Joogitaanka pseudogenes.Pseudogene waa isku xigxiga DNA oo la mid ah hiddo-wadaha caadiga ah laakiin waxa uu lumiyaa shaqadiisa caadiga ah.Waxay inta badan ka jirtaa qoyska hidde-sideyaasha badan ee eukaryotes.Caadi ahaan waxaa matala ψ.Waa nuqul DNA-ga genomic-ga ah oo aan shaqaynayn oo ku jira genome-ka kaas oo aad ula mid ah taxanaha hidde-sidaha codeing., guud ahaan lama qorna, mana laha macne jidheed oo cad.
6. Meesha asaasiga ah marka loo eego exons iyo introns.Sannadihii hore, markii aan xallinay dhibaatada wasakheynta DNA-da, waxaan inta badan fiiro gaar ah siinnay boosaska asaasiga ah, exons, iyo introns, waxaana guud ahaan tixgelinnay naqshadeynta asaasiga ah ee gudaha gudaha si looga fogaado xoojinta DNA-ga.Fadlan eeg shaxanka hoose: madowgu waxa uu u taagan yahay introns, buluugyo kala duwanina waxa ay u taagan yihiin exons, casaanku waxa uu u taagan yahay qormayaasha caadiga ah, casaan dhalaalaysana waxa uu u taagan yahay qormayaasha dhexda ah.

Nidaam, marna run
Waa maxay qorshaha ugu fiican ee tani u muuqataa, laakiin dhab ahaantii, xaaladaha intooda badan, trans-intron primers ma aha sida sixir ah sida loo maleeyo, oo waxay sidoo kale keeni doonaan kordhin aan gaar ah.Markaa sida ugu wanaagsan ee looga hortagi karo wasakheynta DNA-da waa in gebi ahaanba la saaro DNA-da.
7. Saadaasha is-beddelka.Isticmaalka tusaalahan mar kale, isticmaal mFold aaladda khadka tooska ah si aad u go'aamiso qaab dhismeedka labaad ee jajabka bartilmaameedka heerkul gaar ah iyo milix.

Qaab dhismeedka labaad ee RNA heerkul kala duwan
Qaab dhismeedka labaad waa lamaanaynta dhamaystiran ee template laftiisa, taas oo u horseedi doonta tartan xoog leh oo u dhexeeya aasaasiga ah iyo template lammaane, iyo fursadaha xidhitaanka aasaasiga ah waa yar yahay, taasoo keentay in taxane ah dhibaatooyin sida E hoose iyo soo noqnoqda liidata.Iyadoo loo marayo saadaasha software, haddii aysan jirin dhibaato qaab-dhismeedka labaad, taasi way fiicnaan lahayd.Haddii ay jirto, maqaalkeena dabagalku wuxuu si gaar ah uga hadli doonaa sida loo xalliyo dhibaatadan.

MIQE (6)-qPCR Oligonucleotides

PCR-ga tirada badan ee fluorescent, waxa ugu horreeya ee aad maalin walba la halgameyso waa soo saarista RNA, tan labaadna waxay noqon kartaa naqshadda asaasiga ah.
Ugu horreyntii, waxaan wali hubineynaa sharciyada ku saabsan naqshadeynta asaasiga ah sida ku cad liiska hubinta MIQE.Aad bay u fudud tahay in kuwa qallafsan ay qosli karaan, waxaana ku dhameyn karnaa hal jumlad: ogow sida ay isugu xigaan iyo booska baaritaanka asaasiga ah iyo habka wax ka beddelka.Habka nadiifinta asaasiga ah, isku-darka asaasiga ah waa mid aad u jaban hadda, qPCR waxay u qalantaa PAGE iyo hababka nadiifinta ee ka sarreeya, iyo macluumaadka qalabka isku-dhafka ah maaha mid muhiim ah.Dad badan ayaa samaynayey aasaasiyaal tobanaan sano ah mana oga in synthesizerku yahay ABI3900.
Marka la eego mabaadi'da naqshadeynta asaasiga ah, uma baahnid inaad ku xafido iyaga by rote, sababtoo ah inta badan software design design ama online qalab ayaa daryeeli kara dhibaatooyinkan (la taliyay online qalab primer3.ut.ee/), iyo 99.999% ee design aasaasiga ah aan gacanta lagu sameeyo Fiiri, qoraaga mararka qaarkood naqshadeeyo boqollaal ra'iisul maalin kasta, haddii aad mid mid u akhrido, waxa ay noqon doontaa cross-.
Kaliya hubi qodobbada soo socda ka dib marka la nashqadeeyo aasaasayaasha:
1. Naqshad naqshadeeyayaasha u dhow dhamaadka 3′: Xaaladda isticmaalka oligo dT primers ee cDNA-ga ugu horreeya ee isku-dhafka ah, iyada oo la tixgelinayo waxtarka qoraalka dib-u-celinta iyo daacadnimada RNA, naqshadaha naqshadeynta waxay u baahan yihiin in loo qaabeeyo meel u dhow dhammaadka 3' si loo hagaajiyo waxtarka xoojinta.Isticmaal sawir si aad u sharaxdo sida soo socota (ma jirto hab lagu fahmo):

Waa maxay sababta asaasiga ah ee loo qaabeeyey meel u dhow dhammaadka 3′, waa inaysan run ahayn
2. Qiimaha TM: Qiimaha Tm waa 55-65 ° C (maxaa yeelay dhaqdhaqaaqa exonuclease waa kan ugu sarreeya 60 ° C), iyo nuxurka GC waa 40% -60%.
3. QARAX: Si looga fogaado kordhinta aan gaarka ahayn ee genome-ka, Qaraxa waa in loo adeegsadaa xaqiijinta dheeraadka ah.

MIQE(7)-qPCR habka

1. xirmada qPCR
Marka loo eego shuruudaha MIQE, waa inaan si cad u qeexnaa shuruudaha falcelinta dhamaystiran ee maqaalka, oo ay ku jiraan qaabeynta nidaamka falcelinta PCR, xirmada loo isticmaalo, yaa soo saaraha ah, inta uu le'eg yahay nidaamka falcelinta, haddii habka dheeha ama habka baaritaanka loo isticmaalo, goobaha barnaamijka PCR.Darawalada halyeeyada ah ayaa hubaal ah inay ogaan doonaan in ilaa iyo inta xirmada la dooranayo, macluumaadka kor ku xusan asal ahaan waa la go'aamiyay.
Waqtigan xaadirka ah, soo saarista iyo soo saarista xirmooyinka PCR ee tirooyinka fluorescent waa tignoolajiyad aad u bislaaday.Ilaa iyo inta aanad dooran soosaarayaasha aadka u xun, suurtogalnimada dhibaatooyinku maaha mid sarreeya, laakiin waxaan weli rabnaa inaan kula wadaagno dhowr dhibcood:
Bilawga kulul ee Taq enzyme:Qaybta ugu muhiimsan ee PCR waa bilowga kulul ee Taq enzyme.Enzymes-ka bilawga kuleylaha ah ee suuqa ka jira guud ahaan waxa loo qaybiyaa laba nooc, mid waa kimikaad wax laga beddelay-kuleelka bilawga ah (waxaad qiyaasi kartaa in uu yahay paraffin embedding), midda kalena waa enzyme-bilawga kuleelka ah ee wax ka beddelka antibody-ka (antigen-antibody binding).Wax ka beddelka kiimikadu waa dariiqa hore ee enzymes-ku-bilaaban.Marka heerkul gaar ah la gaaro, ensaymku wuxuu sii deyn doonaa hawshiisa.Enzym-bilawga kulul ee wax-ka-beddelay ee ka-hortagga jidhku wuxuu adeegsadaa hababka noolaha si uu u xannibo dhaqdhaqaaqa enzyme-ka.Marka heerkul gaar ah la gaaro, antibody-ga waa la diidi doonaa oo waa la hawlgelin doonaa borotiin ahaan, waxaana la soo gelin doonaa dhaqdhaqaaqa enzyme.

Si kastaba ha ahaatee, waa maxay faa'iidada tani?Tani waa xaaladdu, waxqabadka sii deynta enzymes-ka-hortagga-la beddelay ee enzymes-ka ayaa ka dhaqso badan kan kiimikaad wax laga beddelay, markaa marka la eego dareenka, enzymes-ka-hortagga wax-ka-beddelku waxay leeyihiin faa'iido yar, sidaa darteed asal ahaan ma jiraan enzymes kiimikaad la beddelay oo ku jira xirmooyinka suuqa.Haddii ay jirto, markaa tignoolajiyada soo saaraha ayaa wali ku xayiran xilligii kun-sannaadkii.
fiirsashada Magnesium ion:Feejignaanta ion magnesium aad ayey muhiim ugu tahay falcelinta PCR.Feejignaanta ion magnesium ku habboon waxay kor u qaadi kartaa sii deynta Taq enzyme.Haddii xooga-saarku uu aad u hooseeyo, dhaqdhaqaaqa enzyme si weyn ayaa loo dhimi doonaa;haddii xooga saaridu aad u sarreyso, enzym-catalyzed amplification non-gaar ah ayaa la wanaajin doonaa.Isku-duubnaanta ions magnesium waxay sidoo kale saameyn doontaa nuugista asaasiga ah, heerkulka dhalaalka ee template iyo alaabta PCR, taas oo saameynaysa dhalidda jajabyada la xoojiyay.Feejignaanta ion magnesium waxaa guud ahaan lagu xakameeyaa 25mM.Dabcan, xirmo wanaagsan, xoojinta ions magnesium waa in si fiican loo xakameeyo.Qaar ka mid ah ganacsatada ayaa ku dara wakiilka chelating magnesium ion ee reagent, kaas oo gaari kara saamaynta toos ah u hagaajinta diirada magnesium ion.
Dheejinta dheeha dhaadheer:Midabka Fluorescent, oo ah cagaarka SYBR ee aynu inta badan isticmaalno, wuxuu inta badan dhaliyaa fluorescence isagoo ku xiraya jeexdin yar ee DNA-da laba-geesoodka ah, sababtoo ah ku-xidhka dheeha DNA-da laba-geesoodka ah waa mid aan gaar ahayn, taas oo ah in la yiraahdo Ilaa inta DNA-da laba-jibbaaran ee isku-dhafka ah lagu daro, qaabka fluorescence wuxuu ku dhici karaa habka DNA-ga iyo qaabka DNA-ga.
PS: Sababo la xiriira sifadeeda xasaasiga ah ee iftiinka leh, badeecadaha suuqa yaala waxaa guud ahaan lagu baakadeeyay tuubooyinka centrifuge opaque (sida sawirka hoose ka muuqda).Si kastaba ha ahaatee, tani waxay la kulmi doontaa dhibaato.Way adag tahay in la arko in dareeraha la nuugay marka la qaadayo.Marka la eego, Qingke runtii waa kan ugu saaxiibtinimo badan (sida sawirka hoose ka muuqda), tuubada hufanna waxay ku jirtaa bac daasad ah.Kadibna ku rid bac daasad ah, adigoo tixgelinaya ku habboonaanta ka fogaanshaha iftiinka iyo muunadeynta.Waa inaad doorataa lambarka saxda ah.TSE204 waa jiritaan qiimo sare leh, taas oo iga dhigaysa inaan rabo inaan beero cawska.

Feejignaanta dheeha fluorescent ayaa sidoo kale aad muhiim u ah.Haddii xooga saariddu aad u hooseyso, qalooca cod-weyneyntu kor uma kici doono marxaladda dambe mana aha mid qumman;haddii xoogga saaridu aad u sarreeyo, waxay keeni doontaa faragelin qaylada.Maaddaama PCR-ga cabbirka fluorescent-ka uu inta badan ku xiran yahay qiimaha CT-ga, haddii xoogga-saarista dheeha fluorescent aan si habboon loo hagaajin, barta hoose ayaa ka fiican barta sare.Dabcan, xoojinta dheeha ku habboon ayaa ah kan ugu fiican.

ROX: Midabaynta ROX waxa loo isticmaalaa in lagu saxo khaladaadka calaamada florescence-ka.Qaar ka mid ah soosaarayaasha qalabka waxay u baahan yihiin qalabayn, halka kuwa kalena aysan u baahnayn.Tusaale ahaan, isticmaalka Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR qalabaynta sida caadiga ah waxay u baahan tahay cabbir, oo ay ku jiraan 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, iwm. Tilmaamaha qalabka guud ayaa sifayn doona.
Foregene's qPCR Mix waxa kale oo ka kooban dheeha ROX, kaas oo ku habboon in loo isticmaalo noocyo kala duwan.

Waqtiga dhabta ah PCR Kit-Taqman

Daawaynta curaarta hydrogen ee daciifka ah: Daawaynta curaarta hydrogen ee daciifka ah waa arrin farsamo yar.Ma jiraan wax akhriyey buug-gacmeedyada qalabyo badan, laakiin midkoodna ma xusin mawduucan.Dhab ahaantii, aad bay muhiim u tahay.Isku darka saldhigyadu waxay inta badan ku xiran yihiin xoogga curaarta hydrogen.Xirmooyinka hydrogen-ka xooggan waa kor u qaadis caadi ah, iyo curaarta hydrogen-ka daciifka ah waxay keenaysaa kordhin aan gaar ahayn.Haddii curaarta hydrogen-ka daciifka ah aan si fiican loo baabi'in karin, kordhinta aan gaarka ahayn lama iska ilaalin karo.Marka la eego baaxadda qoraaga, shirkado yar oo keliya ayaa ogaaday dhibaatadan.Markaad iibsanayso qalabka, waxaad tixraaci kartaa haddii aad tixgelisay xalka arrintan ku saabsan xirmada aad rabto inaad doorato.

Mugga falcelinta: Nidaamka 20-50ul ayaa si caadi ah loo isticmaalaa, iyo qiyaasaha yaryar waxay u badan tahay inay keenaan khaladaad.Guud ahaan, tilmaamaha xirmada ayaa ku talin doona isticmaalka qiyaasaha falcelinta PCR.Ha noqon mid caqli badan oo isticmaal mug yar si aad u badbaadiso kharashaadka.yoolka ee.Mugga ay ku taliyeen ganacsatadu dhab ahaantii waa la tijaabiyay, waxaana laga yaabaa in aysan xallin karin dhibaatada khaladaadka ay sababaan tiro yar.
2. Soo saaraha iyo lambarka maqaalka ee saxanka tuubada
Qof kastaa wuu garanayaa mabda'a PCR ee tirooyinka fluorescent.Soo ururinta fluorescence waxaa inta badan lagu fuliyaa iyada oo loo maro koofiyadaha tuubada PCR.Markaad dooranayso alaabta PCR, fiiro gaar ah u yeelo laba dhibcood: gudbinta iftiinka wanaagsan oo ku habboon qalabka.Guud ahaan, looxyada iyo tuubooyinka calaamadaha caadiga ah ayaa fiican, laakiin waa inaad si taxadar leh u doorataa marka la eego la qabsiga, haddii kale ma awoodid inaad isticmaasho qalabka.

4. aqoonta heerka sare

MIQE (8)-qPCR ansaxinta
Tani waa mudnaanta ugu sareysa ee qPCR!Haddaba geesiyaal badan baa halkan ciidda ku soo dhacay.Dabcan, waxa kale oo suurtogal ah in aad nasiib leedahay oo hiddo-wadaha aad baratay ay fudud yihiin, markaa waxaad dhex sabbaysay godka barafka ee dabaysha.Macluumaadka xaqiijinta ee qPCR waxaa loogu talagalay in lagu tijaabiyo isku halaynta xogta.Waxaan u taxnaa macluumaadka xaqiijinta lagama maarmaanka ah sida soo socota:

1.Tijaabada gaarka ah
Gaar ahaan xoojinta hidda-sidaha bartilmaameedka waxaa lagu tijaabiyaa iyadoo la hubinayo in sawirka electrophoresis uu yahay hal koox;hubinta isku xigxiga;qalooca dhalaalaysa si loo eego haddii khariidadda ugu sarreysa ay tahay mid keliya;xaqiijinta dheefshiidka enzyme iyo habab kale.
Halkan, waxaan diirada saareynaa tisaga oo falanqaynaya kor u qaadis aan gaar ahayn isagoo isticmaalaya habka qalooca dhalaalidda.Guud ahaan, marka aan naqshadeyno aasaasayaasha, cabbirka jajabka alaabta ayaa loo baahan yahay inuu ahaado inta u dhaxaysa 80-200bp, taas oo ka dhigaysa heerkulka dhalaalka ee alaabta PCR 80-85 °C.Sidaa darteed, haddii ay jiraan heerar kala duwan, waa in ay jiraan alaabooyin kale oo dheeraad ah oo aan gaar ahayn;haddii heerkulku uu ka hooseeyo 80 ° C, guud ahaan waxaa loo arkaa inuu yahay dimer aprimer;Haddii heerkulku uu ka sarreeyo 85°C, waxaa guud ahaan loo arkaa inay tahay wasakh-DNA ama wax ka badan oo aan kala sooc lahayn oo qaybo waaweyn ah.
Fiiro gaar ah: Mararka qaarkood waxaa jira hal ugu sarreeya oo kaliya 80 ° C.Waqtigaan, fikraddan waa in lagu dhaqmaa.Waxay u badan tahay in natiijadu ay yihiin dhammaan dimers-ka.

Qalooca dhalaalka caadiga ah (hal ugu sarreeya oo aan lahayn wax-weyneyn gaar ah)

Qalooca dhalaalka dhibka leh (kordhinta meelaha ugu sarreeya ee aan gaarka ahayn)
【Kiiska falanqaynta】

Waxaa jira meesha ugu sarreysa, laakiin dimer-ka hore waa halis
Qalooca hal-sare ee shaxanka hoose wuxuu si sahlan u khiyaanayn karaa indhahaaga, adoo u maleynaya inay tahay tijaabo qumman, laakiin natiijadu waa gebi ahaanba khalad.Waqtigaan, waa inaan eegnaa heerkulka dhalaalka.Heerkulka ugu sarreeya wuxuu ka hooseeyaa 80 ° C, kaas oo gebi ahaanba ka sarreeya dimer.

Ma jiro jajab bartilmaameed ah, dhammaan dimers-ka aasaasiga ah
Halkan, walaalkay ma joojin karo.Sawirka hoose waa sawir laga qaaday mobiil uu ii soo diray nin qallafsan.Reagen-yaasha uu isticmaalay dhamaantood waa summadaha sida caadiga ah loo isticmaalo warshadaha.Waxa uu ka beddelay calaamad T-horgale ah oo u beddelay calaamad kale oo T-horgagga ah.Waxaan filayaa in aad horeba u qiyaastay.Dabadhilifkii ayaa igu qayliyay: “Aabaha loo adeegsaday sawirka hore aad buu u fiican yahay, kan ugu sarreeyana waa keli.Ka dib, ka dib markaad isticmaasho reagent-ka aad ku talisay, waxay noqonaysaa sida sawirka labaad, oo leh meelo isku dhafan.Waad i dhibtay."
Kala saar labada garaaf.Jaleecada hore, mid wuxuu leeyahay hal ugu sarreeya, kan kalena wuxuu leeyahay labajibbaaran.Wax aan macno lahayn, hal ugu sarreeya dabcan waa fiican yahay.Taasi ma run baa?
Waxaa ka sii daran Dou E, haddii aan ku dhejiyo labada sawir ee sawirka hoose, waxaad isla markiiba fahmi doontaa.Dhab ahaantii, si fudud ayaannu u curyaaminnay sawirkan oo kale.Falanqaynta taxaddar leh ka dib, waxaan ogaanay in: heerka ugu sarreeya ee jaantuska ugu horreeya uu yahay 75 ° C, kaas oo gebi ahaanba ah dimer;heerka ugu sarreeya ee jaantuska labaad wuxuu u muuqdaa 75 ° C iyo 82 ° C, ugu yaraan waxaa jira badeecada ayaa muuqata.

Sawirada jawaab celinta ardayda
Markaa dhibaatada aasaasiga ah maaha dhibaatada reagents, laakiin dhibaatada naqshadaynta asaasiga ah.Isla mar ahaantaana, waxay sidoo kale caddaynaysaa in qaar ka mid ah noocyada waaweyni aysan ahayn tayada birta, waxayna sidoo kale caddaynaysaa wixii walaalkay hore u yiri: Ma aha calaamadda reagent ee taageeraya maqaalkaaga.Waa maqaalkaaga kan kor u qaaday astaanta reagents.Bal qiyaas, haddi scumbag uusan bedelin reagents, xogta khaldan ayaa loo diri lahaa joornaalka, waxa dhici doonana waxay noqon doontaa masiibo.
2. Qiimaha Ct ee xakamaynta bannaan
Ha sharaxin, haddii kantaroolka bannaan uu leeyahay qiimaha Ct, miyaanay wasakh ahayn?Si kastaba ha ahaatee, waxaad weli u baahan tahay inaad fahamto kantaroolka bannaan ee leh qiimaha Ct.Haddii ay tahay NTC, waxay ka dhigan tahay inuu jiro DNA shisheeye sida wasakhowga reagent.Haddii ay NRT tahay, waxay la macno tahay in RNA-ga la soo saaray uu leeyahay wasakh DNA.
3. Qalooca caadiga ah
Marka lagu daro qaabka jiirada iyo xisaabinta, waxtarka PCR waxaa lagu xisaabin karaa qaacidada.Tijaabada saxda ah waxay u baahan tahay jiirada qalooca caadiga ah inuu u dhawaado 3.32, iyo R² inuu u dhawaado 0.9999.
4. Dhaqdhaqaaq toosan oo toosan
Kala duwanaanshaha firfircoon ee falcelintu waa toosan.Marka loo eego qaab-dhismeedka loo isticmaalo in lagu dhaliyo qalooca caadiga ah, kala duwanaanshaha firfircooni waa inuu ku jiraa ugu yaraan 5 gradients, oo fiiro gaar ah u yeelo isbeddelka qiyamka Ct ee jaangooyooyinka feejignaanta sare iyo jaangooyooyinka hoose.
5. Xaqiijinta ogaanshaha
Isbeddellada natiijooyinka qPCR, taas oo ah, dib-u-soo-celinta liidata, taas oo ah, saxnaanta liidata, waxaa sababa arrimo badan, oo ay ku jiraan heerkulka, xoogga saarista, iyo hawlgalka.Saxnimada qPCR guud ahaan waxa ay noqotaa mid aan la xakamayn karin marka nambarka koobiga uu yaraado.Sida ugu habboon kala duwanaanshaha tijaabada ah, kala duwanaanshahan farsamo waa inuu ka duwan yahay kala duwanaanshiyaha noolaha, iyo nuqullada noolaha ayaa si toos ah wax uga qaban kara kala duwanaanshaha tirakoobka ee natiijooyinka qPCR ee u dhexeeya kooxaha ama daawaynta.Gaar ahaan qiimaynta ogaanshaha, saxnaanta isku-xidhka-qiimaynta ugu wanaagsan (ku celcelintu) dhammaan goobaha iyo hawl-wadeennada waa in la soo sheegaa.
6. Hufnaanta ogaanshaha iyo LOD (oo ku jira multiplex qPCR)
LOD waa fiirsiga ugu hooseeya ee 95% ee muunadaha togan ee la ogaaday.Si kale haddii loo dhigo, fiirsashada LOD ee ku jira jaantusyada hiddo-wadeyaasha bartilmaameedka ah waa in aanay ka badan 5% falcelinta guul-darraystay.Marka la samaynayo falanqaynta multiplex qPCR, gaar ahaan ogaanshaha isku mar ah ee isbeddellada dhibcaha ama polymorphisms, multiplex qPCR waxay u baahan tahay inay bixiso caddaynta in saxnaanta jajabyada bartilmaameedka ah ee badan aan lagu xadgudbin isla tuubo isku mid ah, ogaanshaha badan iyo ogaanshaha hal tuubo Waxtarka iyo LOD waa inay isku mid noqdaan.Gaar ahaan marka hiddo-wadeyaasha bartilmaameedka ah ee xoogga-saarista sare iyo hiddo-wadeyaasha bartilmaameedka hooseeya ay isku mar la kordhiyaan, dhibaatadan waa in fiiro gaar ah loo yeesho.
Dhibaatooyinka iyo xalalkaGuud ahaan, dhibaatooyinka inta badan lagala kulmo qPCR si wax looga beddelo waxay diiradda saaraan dhinacyada soo socda:
· kor u qaadis aan gaar ahayn
· Doorashada adag ee u-fiirsashada asaasiga ah iyo dhibka leh alwaax-dimers
Heerkulka xuubka ayaa khaldan
Qaab dhismeedka sare wuxuu saameeyaa wax-ku-oolnimada
weynayn aan gaar ahayn
weynayn aan gaar ahaynwaxay dhacdaa , guud ahaan waxaa loo tixgeliyaa in naqshadeynta asaasiga ahi aysan ku habooneyn, laakiin haddii aadan ku degdegin inaad bedesho muraayadaha, waxaad isku dayi kartaa hababka soo socda marka hore (mabda'a sidoo kale waa ku lifaaqan yahay):
Kordhi heerkulka xuubka - isku day inaad samayso curaarta hydrogen daciif ah oo aan awoodin inay sii wadato;
· Yaraynta wakhtiga jilitaanka iyo dhererka - waxay yaraysaa fursada curaarta hydrogen daciifka ah;
· Yaree u-fiirsashada asaasiga ah – yarayso fursadda lagu xidhi karo curiyayaasha aan la rabin iyo gobollada aan bartilmaameedka ahayn;
Hufnaanta hooseeysa
Xaaladda ka soo horjeeda kor u qaadis aan gaar ahayn - hufnaanta cod-weyneyn hooseeya , iyo tallaabooyinka lagula tacaalayo waxtarka cod-weyneysiinta hoose waa lid:
· Kordhi wakhtiga soo-jiidashada iyo kordhinta;
U beddelo PCR-ga saddex-tallaabo ah oo yaree heerkulka xuubka;
· Kordhi diiradda hore;
Ps: Arday badan oo qalinjabiyey oo ku dhashay 90-meeyadii ma rabaan inay bartaan sida loo nadiifiyo tijaabooyinka, waxayna rajeynayaan in qalabku uu si buuxda u xallin karo dhibaatada (haddii aad rabto inaad u tagto shirkad reagent ah si aad u sameyso cilmi-baaris iyo horumarin ka dib qalin-jabinta), dhab ahaantii, soo-saareyaasha reagent waxay sidoo kale u maleynayaan habkan, waxaan rajeynayaa inay tahay nacas Waa loo isticmaali karaa markaad hesho, sidaas darteed reagent ee soo-saareyaasha aan la isticmaalin waxay ku bixiyeen xalinta dhibaatada daciifka ah. Qodobbada nuugista ee H-bond.Si aad si fudud u xalliso dhibaatada, nacasyadu wali waa inay akhriyaan hordhaca shirkadda reagent si ay u arkaan haddii ay jirto arrin nuugaya curaarta hydrogen ee daciifka ah.
Doorashada adag ee diirada asaasiga ah iyo dhibka ka yimaada primer-dimers
Habka 1: Guud ahaan marka loo hadlo, tilmaamaha xirmada ee qPCR waxay ku taliyeen nidaamyo iyo qiyaasaha asaasiga ah.
Habka 2: Dejinta adoo dejinaya jaangooyooyinka diiradda saaraya asaasiga ah.Sawirka hoose waa laga xaday shirkad si loo muujiyo.Jaantuska hoose wuxuu muujinayaa natiijooyinka qiyaasta fluorescence ee lagu sameeyay saddex qaybood oo diirad saarid (100nM, 250nM, 500nM) iyo afar jaangooyooyin qaabaysan (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Qiimaha Ct ee natiijooyinka tijaabada waxaa loo qaabeeyey sida soo socota:

Xulashada Muhiimadda Koowaad Isku-keen uruurinta aasaasiga ah ee kasta sida soo socota:

Doorashada fiirsashada asaasiga ahi waa caddahay, xidhiidhka tooska ah ee diirada aasaasiga ah ee 100nM iyo 250nM ayaa ka fiican, iyo xidhiidhka tooska ah ee diirada aasaasiga ah ee 500nM waa mid aad u liita.100nM iyo 250nM, qiimaha Ct ee 250nM aad ayuu u yar yahay, sidaa darteed xooga saarista ugu wanaagsani waa 250nM.Guud ahaan alwaax-dimers daran ayaa lagu arki karaa qalooca dhalaalka.Maxaa dhacaya haddii qalabka loo yaqaan 'primer-dimers' aysan iska ilaalin karin?
Habka 3: Iska yaree xadiga furayaasha oo kordhi heerkulka xinjirowga (looma baahna in la sharaxo).
Qiimaha dhabta ah ee heerkulka annealing waa 60 ° C.Haddii aadan hubin, sidee loo doortaa heerkul aad u yar oo ku habboon?Jawaabtu waxay la mid tahay doorashada feejignaanta asaasiga ah -imtixaan tartiib ah.Sawir ka qaad shirkadda Bio-rad si aad u muujiso dhibaatada.Kordhinta jajab bartilmaameed gaar ah, deji siddeed heerkulbeegyo heerkul ah, mid walbana leh saddex ku celcelin, iyo qalooca cod-weyneysiinta la helay waa sida soo socota:

xulashada heerkulka xumeynaya:
· 70°C, 69°C—Asal ahaan, furayaasha lama isku dari karo, sidaa awgeed ma jiro wax kordhin.
· 67.3°C – Bilawga waxa jira xaddi yar oo kor-u-qaadis ah, qiimaha Ct-na waa mid aad u weyn.
· 64.5°C——Qiimaha Ct ayaa hoos u dhacaya.
· Marka la joogo 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, iyo 55.0°C, qiyamka Ct asal ahaan waxa ay u janjeeraan in ay xasiloonaadaan, laakiin qiyamka fluorescence-ga u dambeeya way kala duwanaayeen.
Sidee loo doortaa?Mabda'a: Mabda'a koowaad waa qiimaha sare ee Ct.Isla qiimaha Ct-ga, dooro heerkul sare oo soo jiidasho leh si aad uga fogaato wax-yeelaynta iyo kordhinta aan gaarka ahayn.Inkasta oo uu jiro qiime sare oo fluorescence ah oo ah 55°C, waxaa laga yaabaa in ay ku jiraan dimers ama cod-weyneyn aan gaar ahayn.
Laakiin haddii aad u caqli badan tahay sidaada oo kale, waxaad hubaal ahaan u malaynaysaa: Si macquul ah, haddii falcelinta PCR ay aad u gaar tahay, ilaa inta diirada aasaasiga ah ay ka badan tahay shuruudaha ugu yar, dhibcaha sare iyo kuwa hooseeya waa inaysan wax saameyn ah ku yeelan, sida midabada fluorescent iyo dNTPs.Runtii, ilaa iyo inta heerkul-ku-qaadista si habboon loo hagaajiyo, saamaynta diirad saarista asaasiga ah ee qiimaha Ct si dabiici ah ayaa loo yarayn doonaa.

Heerkulka xuubka ayaa si sax ah loo hagaajiyay, waxaana la yareeyn doonaa saameynta diirada hore ee CT
Qaab dhismeedka dugsiga sare wuxuu saameeyaa waxtarka xoojinta
Aan sawirka ka soo qaadno Biyo-rad si aan u muujinno dhibka jira.Waxa kale oo ay qaabaysaa heerkulbeeg si ay u xoojiso hiddo-wadaha leh qaab-dhismeedka labaad.

Qaab dhismeedka labaad ayaa soo baxaya
Waxaa la arki karaa in marka heerkulku hoos u dhaco, badeecaduhu bilaabaan inay soo baxaan, qiimaha Ct-ga ayaa hore u socdaa, oo gaaraya qiimaha ugu yar ee 60.7 ° C, ka dibna marka heerkulku hoos u dhaco, qiimaha Ct wuu sii weynaadaa.Taa beddelkeeda, marka heerkulku kordho, qaabka labaad ayaa furmaya oo waxtarka xoojinta ayaa kor u kaca.Ka dib marka la gaaro heerkul gaar ah, kororka heerkulka ma hagaajin karo waxtarka xoojinta.Sababtoo ah furayaasha si adag looma wada dari karo wakhtigan.Sidaa darteed,raadi heerkulka ugu hooseeya ee Ct, kaas oo ah heerkulka ugu fiican ee lagu kordhinayo qaabka qaabdhismeedka sare!Dabcan, nacasyada caqliga leh waa inay ogaadaan in haddii aan loo baahnayn, ay fiicantahay in la beddelo asaasiga ah oo laga fogaado gobolka qaabdhismeedka sare.
5. Heerka codsiga
MIQE — Falanqaynta Xogta

Falanqaynta xogta waxaa inta badan bixiya qalabka PCR ee tirooyinka fluorescent.Maqaalkii hore, shaqo badan oo falanqaynta xogta ah ayaa la sameeyay, sida xakamaynta bannaan, kaas oo lagu sharraxay naqshadaynta tijaabada.Hidde-yaasha tixraaca gudaha, tirooyinka soo noqnoqda, iwm waa la caddeeyay., halkan waxaan inta badan ku sharaxnay codsiga qPCR.
qPCR si weyn ayaa loo isticmaalaa, iyo xaqiijinta tijaabada iyo ogaanshaha aashitada nucleic ayaa ah xaaladaha inta badan la isticmaalo.
qiyaas dhammaystiran
Log (fiirsashada hore) waxay leedahay xidhiidh toos ah tirada wareegyada.Qalooca caadiga ah waxaa laga soo saari karaa halbeeg leh nambarka koobiga bilawga ah ee la yaqaan, taas oo ah, xiriirka toosan ee falcelinta xoojinta waa la heli karaa.Marka loo eego qiimaha Ct ee muunadda, xoogga saarista muunadda waa la xisaabin karaa.Qadarka qaab-dhismeedka lagu daro.

Habka Xisaabinta Tirooyinka Dhabta ah
Tiro dhammaystiran waa in lagu saleeyaa qalooca caadiga ah.Si loo sameeyo qalooca caadiga ah, halbeeg ayaa loo baahan yahay.Caadi ahaan, halbeeggu waa plasmid-ka lagu helo iyadoo la xirayo hiddo-wadaha bartilmaameedka ah.Waa maxay sababta Plasmiid?Sababtoo ah DNA-da plasmid-ka wareega ayaa ah kan ugu xasilloon.Ku walaaq badeecada caadiga ah 5 ilaa 6 gradients iyadoo loo eegayo saamiga labanlaabmay (10-laab qasitaan), oo fiiro gaar ah u yeelo isku midka ah marka la qasi karo.U ogolow qiimaha Ct inuu hoos u dhaco inta u dhaxaysa 15-30.

Diyaarinta caadiga ah
Isla mar ahaantaana, muunadda la tijaabinayo waa in sidoo kale loo milmaa si waafaqsan (xusuusnow qodobka qaska), qiimaha Ct waa inuu sidoo kale hoos u dhacaa inta u dhaxaysa 15-30.Alaabada caadiga ah + muunada la tijaabinayo ayaa la dul saarayaa mishiinka.Ka dib orodka, qalooca caadiga ah ayaa la sameeyay walaxda caadiga ah, muunadaha la tijaabinayo ayaa la keenay qalooca caadiga ah si loo xisaabiyo xoogga.
Hepatitis B fayraska Tirakoobka HBV waa qiyaas buuxa oo caadi ah, kaas oo xisaabin kara nambarka koobiga fayraska ee 1ml oo dhiig ah.
Xisaabinta nambarka koobiga
Tusaalaha u-fiirsashada ee la tijaabinayo (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × factor dilution
Tusaalaha miisaanka kelli = tirada saldhigyada × 324
Nambarka koobiga ee muunadda la tijaabin doono (koobi/ul) = inta ay le'eg tahay muunadda la tijaabinayo / miisaanka kelli ee muunadda × 6 × 1014

Habka xisaabinta ee nambarka koobiga

Kuwa kore waa habka xisaabinta ee lagu go'aaminayo tirada.Tani waa mushkilad xisaabeed oo la xalin karo ka dib marka laga soo baxo dugsiga sare, iyo dhibaatooyinka xisaabta guud ahaan waxaa lagu xalliyaa kombuyuutar.Haddii aadan fahmin, waxaad u iman kartaa inaad la xiriirto.
qiyaasid qaraabo
Tirooyinka qaraabada ah waxaa inta badan loo adeegsadaa cilmi-baarista sayniska.Immisa fayras ayaa ku jira 1ml oo dhiig ah, waana fayraska DNA, tani waa dhacdo la qiyaasi karo: cadadka dhiigga ayaa la go'aamin karaa, fayraska DNA-ga waa mid deggan.Si kastaba ha ahaatee, way nagu adag tahay inaan isbarbar dhigno tirada nuqullada nuqullada hiddo-wadaha qaarkood ee caleen, sababtoo ah way adag tahay in la go'aamiyo xajmiga, miisaanka, iyo jilicsanaanta caleenta, qadarka RNA ee la soo saaray way adag tahay in la go'aamiyo, iyo waxtarka qoraalka gadaasha sidoo kale way adag tahay in la go'aamiyo , taas oo ah in la yiraahdo, tallaabo kasta waxay ka dhigi kartaa xogta tijaabada inay leedahay cillado oo aan la isticmaali karin.
Sidaa darteed, qiyaasitaan qaraabo waa in ay soo bandhigtaa curiye:hiddaha tixraaca gudaha .
Si kale haddii loo dhigo, qiyaasid qaraabo ah ayaa dhab ahaantii isbarbardhigga u dhexeeya hidda-wadaha bartilmaameedka ah iyo hiddaha tixraaca gudaha.Marka la barbar dhigo isla unug isku mid ah iyo isla unug, saamaynta cabbirka muunadda, qaddarka soo saarista RNA, hufnaanta qoraalka rogaal celinta, iyo waxtarka PCR waa mid yar.Sababtoo ah cabbirka saamiga yar, labadaba hiddo-wadaha tixraaca gudaha iyo hiddo-wadeyaasha bartilmaameedka ayaa yara yaraatay.Tani waa sababta aan hore ugu adkeynay isku midnimada iyo xasilloonida.
Hiddo-sidaha tixraaca gudaha guud ahaan waahiddaha ilaalinta guriga(Guryaha ilaalinta guriga), kuwaas oo tixraacaya fasalka hiddo-wadaha kuwaas oo si adag loogu muujiyey dhammaan unugyada, iyo alaabooyinkoodu waa lagama maarmaan si loo ilaaliyo hawlaha nolosha aasaasiga ah ee unugyada.
Ha isku khaldin fikradan.Hidde-sideyaasha gurigu waa ereyada shaqada nafleyda, halka hiddo-wadaha tixraaca gudaha uu yahay ereyo farsamo oo tijaabo ah.Hidde-sideyaasha guriga waxay u baahan yihiin inay gudbaan ansaxinta ka hor inta aan loo dooran hiddo-wadaha tixraaca gudaha.
Tusaale ahaan, waxaanu dooranay dhowr hidde-hayneed oo ku yaal sawirka hoose si aan u tijaabino heerarkooda muujinta unugyada unugyada kala duwan, waxaana ogaanay in heerarka muujinta β-2-microglobulin ay aad uga duwan yihiin kuwa saddexda hidde-side ee kale, sidaas darteed looma isticmaali karo hiddo-wadaha tixraaca gudaha.

Ka dib markii la fahmo shaqada sixitaanka ee hidda-socodka tixraaca gudaha, laba algorithms ayaa la soo saaray sababtoo ah soo bandhigida hiddaha tixraaca gudaha.
Habka qalooca caadiga ah ee laba jibaaran
·2 – △△ Habka Ct (Qaabka isbarbardhigga qiimaha CT)
Haddii aad xiisaynayso inaad barato noocyada iyo shaqooyinka hidda-wadaha, fadlan iska dhaaf cilmi-baarista algorithms oo si toos ah u isticmaal qaacidooyinka, ama si toos ah u isticmaal mashiinnada;Haddii aad tahay nin toosan oo xisaabta iyo injineernimada ah, fadlan xor u noqo.
habka qalooca caadiga ah double
Tiriye hiddo-sidaha bartilmaameedka ah iyo hidda-waynta guriga ee muunadda kantaroolka iyo muunadda lagu tijaabinayo qalooca caadiga ah, ka dibna xisaabi qiimaha qaraabada iyadoo loo eegayo qaacidada xisaabinta, taas oo ah heerka cabbirka qaraabo.
Faa'iidooyinka: falanqaynta fudud, hagaajinta tijaabada ah ee fudud
Khasaaro: Hidde kasta, wareeg kasta oo tijaabo ah waa inay sameeyaan qalooca caadiga ah
Codsiga: Mid ka mid ah labada hab ee sida caadiga ah loo isticmaalo oo la aqoonsan yahay hab qiyaaseed qaraabo ah ee daraasaadka xeerka muujinta hiddo-wadaha
Habkani waa sida soo socota:

Tusaalooyinka waa sida soo socota:

Xisaabi qaddarka qaraabada ah iyadoo lagu saleynayo natiijada tirada
2 - △△ Habka Ct (hab isbarbardhigga qiimaha CT)

Faa'iidooyinka: Looma baahna in la sameeyo qalooca caadiga ah
Khasaaraha: Waxaa loo malaynayaa in waxtarka-weyneyntu ku dhowdahay 100%;weecasho heerku waa <5%, iyo qalooca caadiga ah iyo hufnaanta u dhaxaysa cod-weyneyste kasta waxa loo malaynayaa inay joogto;hagaajinta xaaladaha tijaabada ayaa aad u dhib badan.
Codsiga: Mid ka mid ah labada hab ee sida caadiga ah loo isticmaalo oo la aqoonsan yahay hab qiyaaseed qaraabo ah ee daraasaadka xeerka muujinta hiddo-wadaha

Dabcan, hufnaanta cod-weyneysiinta inta badan waa wax aan suurtagal ahayn in si qumman loo dhigo qaacidada xisaabinta waxaa lagu sixi karaa 1.95 △△ Ct
Ilaa hadda, nuxurka ku saabsan PCR-ga tireed ee fluorescent wuu dhammaaday.