Asalkii naqshadeynta aasaasiga ah (99% dhibaatooyinka waa la xallin karaa)
1. Dhererka hore: Buuggu wuxuu u baahan yahay 15-30bp, badiyaa qiyaastii 20bp.Xaaladda dhabta ah waxay ku fiican tahay in ay noqoto 18-24bp si loo hubiyo gaar ahaanta, laakiin muddada dheer ee ka sii fiican, raajada aad u dheer ayaa sidoo kale yareyn doonta gaar ahaaneed, waxayna yareyn doontaa wax-soo-saarka.
2. Baaxadda sare u qaadida: 200-500bp ayaa ku habboon, jajabkuna waa la ballaarin karaa ilaa 10kb xaalado gaar ah.
3. Saldhigga aasaasiga ah: Waxa ku jira G+C waa in ay ahaataa 40-60%, saamayn aad u yar ee G+C ma fiicna, G+C aad u badan way fududahay in ay u muuqato kooxo aan gaar ahayn.ATGC si fiican ayaa loo qaybiyaa si aan kala sooc lahayn, iyada oo laga fogaanayo rucubyada in ka badan 5 purine ama pyrimidine nucleotides.Multi-gc ee dhamaadka 5′ iyo taxanaha dhexe si loo kordhiyo xasiloonida, iska ilaali GC hodanka ah dhamaadka 3′, GC ma jiro 3da saldhig ee ugu dambeeya, ama GC maya 3 ee 5ta saldhig ee ugu dambeeya.
4. Ka fogow qaab-dhismeedka sare ee aasaasiga ah, kana fogow dhammaystirka u dhexeeya laba qormooyin, gaar ahaan dhammaystirka 3 'dhamaadka, haddii kale dimer-ka-soo-saarka ayaa la samayn doonaa waxaana la soo saari doonaa kooxo-xoojin ah oo aan gaar ahayn.
5. Saldhigyada 3 'dhammaadka asaasiga ah, gaar ahaan kuwa ugu dambeeya iyo saldhigyada ugu dambeeya, waa in si adag loo lamaaniyaa si looga fogaado fashilka PCR sababtoo ah saldhigyada terminaalka ee aan la-lammaan-qaadin.
6. Furayaasha ayaa leh ama lagu dari karaa goobo ku habboon oo la jeexjeexay, iyo isku xigxiga bartilmaameedka la xoojiyay waa in ay doorbidaan goobo ku habboon, taas oo faa'iido badan u leh falanqaynta jeexjeexa ama molecular cloning.
7. Gaarka ah ee asaasiga ah: aasaasiyaasha waa in aysan yeelanin isku-dhismeed cad oo leh taxane kale oo ku jira xogta taxanaha aashitada nucleic.
8. Baro isticmaalka software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Nashqadan online-ka ah ayaa si fiican u shaqeysa).
Nuxurka kore wuxuu xallin karaa ugu yaraan 99% dhibaatooyinka naqshadaynta asaasiga ah.
Xakamee faahfaahinta naqshadaynta asaasiga ah
1. Dhererka hore
Dhererka asalka guud waa 18 ~ 30 saldhig.Guud ahaan, qodobka ugu muhiimsan ee go'aaminaya heerkulka annealing ee asaasiga ah waa dhererka asaasiga ah.Heerkulka xididada xididada guud ahaan waa la doortaa (qiimaha Tm -5℃), qaarna waxay si toos ah u isticmaalaan qiimaha Tm.Qaababka soo socda ayaa loo isticmaali karaa si qiyaas ahaan loo xisaabiyo heerkulka xididada.
Marka dhererka asalkiisu ka yar yahay 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Marka dhererka alwaaxdu uu ka weyn yahay 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC) -500/dhererka-5℃
Intaa waxaa dheer, barnaamijyo badan ayaa sidoo kale loo isticmaali karaa si loo xisaabiyo heerkulka annealing, mabda'a xisaabinta ayaa noqon doona mid ka duwan, sidaas darteed mararka qaarkood qiimaha la xisaabiyay ayaa laga yaabaa inuu leeyahay farqi yar.Si loo hagaajiyo falcelinta PCR, aasaasayaasha ugu gaagaaban ee hubinaya heerkulka aan ka yarayn 54℃ ayaa loo isticmaalaa waxtarka iyo gaar ahaaneed ee ugu fiican.
Guud ahaan, qeexida asaasiga ahi waxay ku korodhaa afar qodob mid kasta oo nucleotide dheeraad ah, sidaa darteed dhererka asaasiga ah ee ugu yar ee codsiyada badankiisa waa 18 nucleotide.Xadka sare ee dhererka asaasiga ah aad muhiim uma aha, inta badan waxay la xiriirtaa waxtarka falcelinta.Sababtoo ah entropy, inta ka sii dheer ee asaasiga ah, ayaa hoos u dhigaya heerka ay ku xiran tahay DNA-da bartilmaameedka si loo sameeyo template labajibbaaran oo deggan oo loogu talagalay polymerase DNA si loo xiro.
Markaad isticmaaleyso softiweer si aad u naqshadeyso aasaasayaasha, dhererka asaasiga ah waxaa lagu go'aamin karaa qiimaha TM markeeda, gaar ahaan kuwa loo yaqaan 'primers of fluorescence quantitative PCR', TM=60℃ ama wax la mid ah waa in la xakameeyaa.
2.GC nuxurka
Guud ahaan, waxa ku jira G+C ee taxanaha asaasiga ahi waa 40% ~ 60%, iyo waxa ku jira GC iyo qiimaha Tm ee lammaanaha aasaasiga ah waa in la isku duwo.Haddii ra'iisul-saaruhu uu leeyahay dareen GC ama AT halis ah, qaddarka habboon ee A, T ama G iyo dabada C ayaa lagu dari karaa 5 'dhammaadka aasaasiga ah.
3. heerkulka Annealing
Heerkulku waa inuu ka hooseeyaa 5℃ heerkulka aan silsiladda lahayn.Haddii tirada saldhigyada asaasiga ahi ay yar yihiin, heerkulka xajinta ayaa si habboon loo kordhin karaa, taas oo kordhin karta qeexida PCR.Haddii tirada saldhigyadu ay badan yihiin, heerkulka annealing si habboon ayaa loo dhimi karaa.Farqiga heerkulka nuglaanta ee u dhexeeya lamaanaha aasaasiga ah ee 4 ℃ ~ 6 ℃ ma saameyn doonto wax soo saarka PCR, laakiin sida ugu habboon heerkulka nuugista ee lamaanaha aasaasiga ah waa isku mid, kaas oo ku kala duwanaan kara inta u dhaxaysa 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Ka fogow aagga qaab-dhismeedka sare ee qaab-dhismeedka cod-weyneysiinta
Way fiicantahay in laga fogaado gobolka qaab dhismeedka sare ee template marka la dooranayo jajabka la xoojiyay.Qaab dhismeedka sare ee xasilloon ee jajabka bartilmaameedka waxaa la saadaalin karaa oo lagu qiyaasi karaa software kombuyuutar oo ku habboon, kaas oo waxtar u leh xulashada qaabka.Natiijooyinka tijaabada ahi waxay muujinayaan in balaadhinta inta badan lagu guulaysan waayo marka tamarta xorta ah (△G) ee gobolka la ballaadhinayo ay ka yar tahay 58.6lkJ/mol.
5. Iskuma la'aanta DNA-da bartilmaameedka ah
Marka isku xigxiga DNA-da la xoojiyey ee bartilmaameedku weyn yahay, asal-bixiye ayaa laga yaabaa inuu ku xidho qaybo badan oo DNA-da la beegsanayo, taasoo keentay in guuto badan ay ka soo baxaan natiijada.Markan waxaa lagama maarmaan ah in la isticmaalo baaritaanka software-ka BLAST, mareegaha:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Dooro Isku toosi laba taxane (bl2seq).
Ku dhajinta taxanaha asaasiga ah ee aaga 1 iyo bartilmaameedka taxanaha DNA ee aaga 2 waa la isweydaarsan karaa, oo BLAST waxay xisaabisaa dhamaystirka, dareen diidista, iyo fursadaha kale, markaa isticmaalayaashu uma baahna inay ogaadaan in labada silsiladood ay yihiin silsilado dareen.Waxa kale oo aad geli kartaa lambarka GI-ga haddii aad taqaano lambarka GI ee isku xigxiga ee kaydinta, si aanad u dhejin qayb weyn oo ka mid ah taxanaha.Ugu dambeyntii, dhagsii Isku toosi 3 si aad u aragto haddii furaha uu leeyahay goobo isku mid ah oo ku jira DNA-da la beegsanayo.
6. Terminalka koowaad
Dhamaadka 3 'dhammaadka aasaasiga ah waa halka kordhintu ay ka bilaabato, markaa waa muhiim in laga hortago is-maandhaafku inuu halkaas ka bilaabo.Dhamaadka 3 'dhammaadka waa inuusan ka badnaan 3 G ama C oo isku xigta, sababtoo ah tani waxay sababi doontaa in furaha si khalad ah u kiciyo G+C ee isku xigxiga ee kobcinta.3 'dhamaadka ma samayn karo qaab-dhismeed sare, marka laga reebo falcelinta PCR (AS-PCR) ee gaarka ah, 3'da dhammaadka asaasiga ah lama isbarbar dhigi karo.Tusaale ahaan, haddii gobolka codeynta la kordhiyo, 3 'dhammaadka primer waa in aan lagu joojin booska saddexaad ee codon, sababtoo ah booska saddexaad ee codonku wuxuu u nugul yahay inuu xumaado, taas oo saameyn doonta gaarnimada iyo waxtarka xoojinta.Markaad isticmaalayso annexation annexation, tixraac miiska isticmaalka codonka, fiiro gaar ah u yeelo dookhyada noolaha, ha isticmaalin qormayaasha lifaaqa ee dhamaadka 3′, isticmaal xaddi sare oo ah furayaasha (1uM-3uM).
7. Qaab dhismeedka labaad ee asaasiga ah
Furayaasha laftoodu waa inaysan yeelanin taxane is-dhajin ah, haddii kale furayaasha laftoodu waxay isku laaban doonaan qaab-dhismeedka timaha, iyo qaab-dhismeedkan labaad wuxuu saameyn doonaa xidhitaanka furayaasha iyo qaab-dhismeedka sababtoo ah caqabado adag.Haddii xukun macmal ah la isticmaalo, saldhigyada is-kaabaya ee joogtada ah ee aasaasiga ah laftoodu waa inaysan ka badnaan 3bp.Waa in aanay jirin wax is-kabaya oo u dhexeeya labada curiye, gaar ahaan is-ku-darka dhammaystirka ah ee 3 'dhamaadka waa in laga fogaadaa si looga hortago samaynta dimers primer.Guud ahaan, waa in aanay jirin wax ka badan 4 saldhig oo isku xigta oo isku xidhan ama is dhammaystira oo u dhexeeya lamaanaha aasaasiga ah.
8. Ku dar calaamado ama loci
5'dhamaadka waxa ay saameyn yar ku leedahay gaar ahaan kor u qaadida sidaas awgeedna waa la bedeli karaa iyada oo aan wax saameyn ah ku yeelan gaar ahaanta kordhinta.Wax ka beddelka asaasiga 5 'dhamaadka waxaa ka mid ah: ku darista goobta xaddidaadda ensaymka;Biotin calaamadeysan, fluorescence, digoxin, Eu3+, iwm. Soo bandhig taxanaha DNA-da ee ku xiran borotiinka;Soo bandhigida goobaha isku-beddelka, gelinta iyo is-beddelka isku xigxiga ee maqan iyo soo bandhigida taxanaha dhiirrigeliyeyaasha, iwm. Saldhigyada dheeraadka ah waxay saameyn doonaan wax-ku-oolnimada kordhinta waxayna kordhinayaan fursadda samaynta dimer-ka-soo-saarka, laakiin xoogaa tanaasulaad ah waa in la sameeyaa tallaabada xigta.Taxanayaal dheeri ah oo aan ka jirin isku xigxiga yoolka, sida goobaha xaddidaadda iyo taxanaha dhiirrigeliyeyaasha, ayaa lagu dari karaa 5′ dhammaadka furaha iyada oo aan saameyn ku yeelanayn gaar ahaaneed.Tixanahan laguma darin xisaabinta qiyamka Tm Primer, laakiin waa in lagu tijaabiyaa dhamaystirka iyo qaabdhismeedka sare ee gudaha.
9. Subclones
Waqtiga intiisa badan, PCR waa kaliya cloning horudhac ah, ka dibna waxaan u baahanahay inaan hoos u dhigno jajabka bartilmaameedka ee vectors kala duwan, markaa waxaan u baahanahay inaan u naqshadeyno saldhigyo dheeraad ah hawlgalka xiga ee tallaabada PCR.
Qaar ka mid ah taxanaha loogu talagalay subcloning ayaa lagu soo koobay hoos.
Xakamaynta goobta xaddidaadda endonuclease ayaa lagu daray
Ku darista goobaha xaddidaadda ensaymku waa habka ugu badan ee loo isticmaalo hoos-u-dhigga alaabta PCR.Guud ahaan, goobta la jeexjeexay waa lix saldhig, marka lagu daro 5 'dhammaadka goobta dillaaca waxay u baahan yihiin in lagu daro 2 ~ 3 saldhigyo ilaalin ah.Si kastaba ha noqotee, tirada saldhigyada ilaalinta ee loo baahan yahay enzymes kala duwan ayaa ka duwan.Tusaale ahaan, SalⅠ uma baahna saldhig ilaalin, EcoRⅤ waxay u baahan tahay 1 saldhig ilaalin ah, NotⅠ waxay u baahan tahay 2 saldhig oo ilaalin ah, Hind Ⅲna waxay u baahan tahay 3 saldhig oo ilaalin ah.
LIC waxay ku daraysaa dabada
Magaca buuxa ee LIC waa LIC-independent cloning, habka cloning ee uu ikhtiraacay Navogen gaar ahaan qaybteeda pET vector.Siday PET-da ee ay diyaarisay habka LIC waxa uu leeyahay cidhifyo dhegdheg ah oo aan dhammaystirnayn oo ah 12-15 saldhig, kaas oo dhammaystiraya darafyada dheggagga u dhigma ee jajabka la geliyo bartilmaameedka.Ujeedooyinka kor-u-qaadista, horudhaca 5′ ee isku xigxiga ee jajabka la geliyey waa inuu buuxiyaa vector-ka LIC.Dhaqdhaqaaqa 3'→5' ee ka baxsan T4 DNA polymerase wuxuu samayn karaa hal xadhig oo dhegdheg ah oo ku yaal jajabka la geliyo wakhti gaaban ka dib.Sababtoo ah badeecada waxaa laga samayn karaa oo kaliya ka-soo-kabashada wadajirka ah ee jajabka la diyaariyey iyo vector, habkani waa mid aad u dhakhso badan oo hufan, waxaana loo hagayaa cloning.
TA clone la hagayo ku dar dabada
TA cloning waxay awoodi wayday inay bar-tilmaameedsato jajabka qayb ka mid ah vector, sidaas darteed markii dambe Invitrogen wuxuu soo bandhigay vector bartilmaameedsan kara cloning, kaas oo ka kooban afar saldhig oo caan ah GTGGS hal daraf.Sidaa darteed, naqshadeynta aasaasiga ah ee PCR, waa in lagu daraa taxane is-kaabayaal ah si waafaqsan, si jajabku u noqon karo "oriented".
Haddii wakhtigu ku yar yahay, waxaad isku dayi kartaa isku-dubarid toos ah, adigoo isku daraya hidda-wadaha iyo vector-ka, taas oo ah waxa aan ugu yeerno ET gene synthesis ee musecularists.
D. Habka cloning In-Fusion
Looma baahna ligase, looma baahna falcelin dheer.Ilaa inta isku xigxiga ee labada daraf ee vector linearized la soo bandhigay Naqshadeynta asaasiga ah, ka dibna alaabta PCR iyo vector linearized ayaa lagu daraa xalalka enzyme in-fusion-ka oo ka kooban BSA oo lagu dhejiyo heerkulka qolka nus saac, isbeddelka waa la samayn karaa.Habkani wuxuu si gaar ah ugu habboon yahay beddelka mugga weyn.
10. Isku-darka asaasiga ah
Mararka qaarkood, kaliya macluumaadka isku xigxiga ee xaddidan ayaa laga yaqaanaa naqshadaynta asaasiga ah.Tusaale ahaan, haddii la og yahay oo kaliya isku xigxiga amino acid, aasaasaha isku darka waa la qaabayn karaa.Isku-darka aasaasiga ah waa isku-dar ah taxane kala duwan oo matalaya dhammaan fursadaha sal ee kala duwan kuwaas oo qeexaya hal amino acid.Si aad u kordhiso qaas ahaanta, waxaad tixraaci kartaa miiska isticmaalka codonka si loo yareeyo ku darida iyadoo loo eegayo doorbidida isticmaalka aasaasiga ah ee noolaha kala duwan.Hypoxanthine waxaa lagu lamaanayn karaa dhammaan saldhigyada si loo dhimo heerkulka soo jiidashada ee asaasiga ah.Ha u isticmaalin saldhigyada lifaaqan ee 3′ dhamaadka furaha sababtoo ah baabiinta 3da saldhig ee ugu dambeeya dhamaadka 3′ ayaa ku filan in PCR laga bilaabo goob khaldan.Heerarka aasaasiga ah ee sare (1μM ilaa 3μM) ayaa la isticmaalaa sababta oo ah furayaasha isku-darka badan ee isku-darka ah maaha kuwo gaar u ah qaab-dhismeedka bartilmaameedka.
PCR alaabta ceeriinxakamayn
1. Tirada koowaad
Isku-dubarid kasta oo curiye ah waa 0.1 ~ 1umol ama 10 ~ 100pm.Way fiicantahay in la soo saaro natiijada loo baahan yahay oo leh qadarka ugu hooseeya ee asaasiga ah.Isku-duubnida sare ee asaasiga ahi waxay keeni doontaa is-waafajin iyo weynayn aan gaar ahayn, waxayna kordhinaysaa fursadda samaynta dimers inta u dhaxaysa aasaasayaasha.
2. Diiradda koowaad
Isku-duubnaanta asaasiga ahi waxay saamaysaa gaarnimada.Heerarka ugu fiican ee asaasiga ahi guud ahaan waa inta u dhaxaysa 0.1 iyo 0.5μM.Heerarka asaasiga ah ee sarreeya waxay keenayaan kordhinta alaabada aan gaarka ahayn.
3. Heerkulka xuubka ee asaasiga ah
Halbeegga kale ee muhiimka ah ee asaasiga ah waa heerkulka dhalaalka (Tm).Tani waa heerkulka marka 50% aasaasayaasha iyo taxanaha is-kaabaya ay u taagan yihiin unugyo DNA-da laba-jibbaaran.Tm ayaa loo baahan yahay si loo dejiyo heerkulka soo jiidashada PCR.Sida ugu fiican, heerkulka annealing waa hooseeyaa oo ku filan si loo hubiyo in si wax ku ool ah u baabi'inta asaasiga ah ee taxanaha bartilmaameedka, laakiin aad u sarreeya si loo yareeyo xidhitaanka aan khaaska ahayn.Heerkulka wax-soo-saarka macquulka ah ee laga bilaabo 55 ℃ ilaa 70 ℃.Heerkulka xajinta ayaa guud ahaan la dejiyay 5℃ ka hooseeya Tm ee primer.
Waxaa jira qaabab badan oo loo dejiyo Tm, kuwaas oo aad u kala duwan iyadoo ku xiran qaaciidada la isticmaalay iyo sida ay u kala horreeyaan.Sababtoo ah qaaciidooyinka intooda badani waxay bixiyaan qiime lagu qiyaasay Tm, dhammaan heerkulku waa barta bilawga ah.Gaar ahaan waxaa lagu wanaajin karaa iyadoo la falanqeynayo dhowr fal-celin kuwaas oo si tartiib tartiib ah kor ugu qaadaya heerkulka xuubka.Ka bilow hoos qiyaasta Tm-5℃, oo si tartiib tartiib ah u kordhi heerkulka jilbiska ah ee korodhka 2℃.Heerkulka sare ee nuugista ayaa yarayn doona samaynta dimers-ka aasaasiga ah iyo alaabta aan gaarka ahayn.Natiijooyinka ugu wanaagsan, labada aasaasi waa inay lahaadaan qiyaaso Tm ah.Haddii farqiga Tm ee lammaanaha aasaasiga ahi uu ka badan yahay 5℃, aasaasayaashu waxay muujinayaan bilow been ah oo muhiim ah iyagoo isticmaalaya heerkul hoose oo xididada wareegga.Haddii labada aasaasi ee Tm ay kala duwan yihiin, dhig heerkulka soo jiidashada ilaa 5℃ ka hooseeya Tm ugu hooseeya.Taas beddelkeeda, si loo kordhiyo gaar ahaaneed, shan wareeg ayaa marka hore lagu samayn karaa heerkulbeegyo loogu talagalay Tm sare, oo ay ku xigto wareegyada soo hadhay ee heerkulbeegyada annealing ee loogu talagalay Tm hoose.Tani waxay u oggolaanaysaa nuqul ka mid ah qaabka loo socdo in lagu helo xaalado adag.
4. nadiifnimada iyo xasiloonida asaasiga ah
Nadiifinta caadiga ah ee aasaasiga ah ayaa ku filan inta badan codsiyada PCR.Ka saarista kooxaha benzoyl iyo isobutylyl marka la nadiifiyo ayaa ah mid aad u yar oo sidaas darteed ma faragelinayso PCR.Codsiyada qaarkood waxay u baahan yihiin nadiifin si meesha looga saaro isku xigxiga aan dhererka buuxa ahayn ee habka isku xidhka.Tixanahan la jarjaray ayaa dhacaya sababtoo ah waxtarka kimisteriga isku dhafka DNA ma aha 100%.Tani waa hab wareeg ah oo isticmaala falcelin kiimikaad oo soo noqnoqda iyadoo saldhig kasta lagu daro si DNA looga sameeyo 3′ ilaa 5′.Waxaad ku guuldareysan kartaa labada wareeg.Qoryaha dhaadheer, gaar ahaan kuwa ka weyn 50 saldhig, waxay leeyihiin qayb weyn oo taxane ah oo la jarjaray waxaana laga yaabaa inay u baahdaan nadiifin.
Wax-soo-saarka asaasiga ah waxaa saameeya waxtarka kiimikada synthetic iyo habka nadiifinta.Shirkadaha biopharmaceutical, sida Cytology iyo Shengong, dhamaantood waxay isticmaalaan unugga OD ee ugu yar si loo hubiyo wadarta wax soo saarka oligonucleoside.Aasaaska caadiga ah waxaa lagu soo raray qaab budo qalalan.Way fiicantahay in dib loo kala diro furayaasha TE si ay u fiirsashada ugu dambeysa ay u noqoto 100μM.TE way ka fiican tahay biyaha deionized sababtoo ah pH-ga biyuhu inta badan waa acidic waxayna sababi doontaa hydrolysis ee oligonucleosides.
Xasiloonida aasaasiga ah waxay kuxirantahay xaaladaha kaydinta.Budada qallalan iyo agabyada kala diri waa in lagu kaydiyaa -20 ℃.Furayaasha ku milmay TE marka la uruuriyo in ka badan 10μM waxaa si joogto ah loogu kaydin karaa -20℃ ilaa 6 bilood, laakiin kaliya waxaa lagu kaydin karaa heerkulka qolka (15℃ ilaa 30℃) in ka yar 1 toddobaad.Qoryaha qallalan ee budada ah ayaa lagu kaydin karaa -20 C ugu yaraan 1 sano iyo heerkulka qolka (15 C ilaa 30 C) ilaa 2 bilood.
5. Enzymes iyo uruurintooda
Waqtigan xaadirka ah, Taq DNA-ga polymerase ee loo isticmaalo asal ahaan waa injineernimada hidde-sideyaasha oo ay soo saartay bakteeriyada coliform.Qadarka enzyme loo baahan yahay si loo kiciyo falcelinta PCR ee caadiga ah waxay ku saabsan tahay 2.5U (waxaa loola jeedaa wadarta mugga falcelinta ee 100ul).Haddii xooga saaridu aad u sarreeyo, waxay u horseedi kartaa kordhin aan gaar ahayn;haddii xooga saaridu aad u hooseyso, qadarka alaabta synthetic waa la dhimi doonaa.
6. Tayada iyo xoojinta dNTP
Tayada dNTP waxay si dhow ula xiriirtaa fiirsashada iyo waxtarka kordhinta PCR.Budada dNTP waa granular, kala duwanaanshaheedana waxay luminaysaa dhaqdhaqaaqeeda bayooloji haddii si khaldan loo kaydiyo.Xalka dNTP waa acidic, waana in loo adeegsadaa feejignaan sare, oo leh 1M NaOH ama 1M Tris.HCL xal kaydinta si loo hagaajiyo PH ilaa 7.0 ~ 7.5, qadar yar oo baakad hoose ah, kaydinta barafaysan ee -20 ℃.baraf-dhalaalitaan badan ayaa hoos u dhigaya dNTP.Dareen-celinta PCR, dNTP waa inay noqotaa 50 ~ 200umol/L.Khaasatan, waa in fiiro gaar ah loo yeeshaa fiirsiga afarta DNTPS waa in ay ahaato mid siman (diyaarinta mole siman).Haddii xoogga mid ka mid ah uu ka duwan yahay kuwa kale (sare ama ka hooseeya), isku-dheelitirnaan la'aanta ayaa sababi doonta.Fiirinta aad u yar waxay yaraynaysaa wax soo saarka PCR.dNTP waxay ku dari kartaa Mg2+ waxayna yarayn kartaa fiirsashada Mg2+ bilaash ah.
7. Template ( hiddo-sidaha bartilmaameedka ) nucleic acid
Qadarka iyo heerka nadiifinta ee template nucleic acid waa mid ka mid ah isku xirka muhiimka ah ee guusha ama guuldarada PCR.Hababka sifaynta DNA-da ee soo jireenka ah waxay badiyaa isticmaalaan SDS iyo protease K si loo dheefshiido oo loo tuuro muunadaha.Hawlaha ugu muhiimsan ee SDS waa: milaan dufanka iyo borotiinka xuubka unugyada, sidaas darteed burburinta xuubka unugga iyadoo la burburinayo borotiinka xuubka, iyo kala qaybinta borotiinka nukliyeerka ee unugyada, SDS waxay sidoo kale isku dari kartaa borotiinno iyo soo dajin;Protease K waxa uu daadi karaa oo dheefshiidi karaa borotiinada, gaar ahaan histones ku xidhan DNA-da, ka dibna waxa ay isticmaalaan phenol dareeraha organic iyo chloroform si ay borotiinada iyo qaybaha kale ee unugyada u soo saaraan, oo ay isticmaalaan ethanol ama khamriga isopropyl si ay u soo kiciyaan nucleic acid.Aashitada nucleic-ka ah ee la soo saaray waxaa loo isticmaali karaa tusaale ahaan falcelinta PCR.Noocyada ogaanshaha guud ee bukaan-socodka, hab fudud oo degdeg ah ayaa loo isticmaali karaa in lagu milmo unugyada, lysate pathogens, dheefshiidka iyo ka saarida borotiinka koromosoomyada ilaa hiddo-wadeyaasha bartilmaameedka ah ee bilaashka ah, oo si toos ah loo isticmaalo kordhinta PCR.Soo saarista template RNA waxay badanaa isticmaashaa guanidine isothiocyanate ama habka protease K si looga hortago RNase inay hoos u dhigto RNA.
8.Mg2+ xoojinta
Mg2+ waxay saameyn weyn ku leedahay gaar ahaanta iyo wax-soosaarka kor u qaadida PCR.Guud ahaan falcelinta PCR, marka fiirsashada dNTP kala duwan ay tahay 200umol/L, fiirsashada habboon ee Mg2+ waa 1.5 ~ 2.0mmol/L.Mg2+ diiradda ayaa aad u sarreeya, gaar ahaan falcelinta falcelinta ayaa hoos u dhacda, kordhinta aan khaaska ahayn ayaa dhacda, fiirsashada aad u yar ayaa yareyn doonta waxqabadka Taq DNA polymerase, taasoo keentay hoos u dhaca alaabta falcelinta.
Iions Magnesium wuxuu saameeyaa dhowr qaybood oo PCR ah, sida waxqabadka DNA polymerase, kaas oo saameeya wax-soo-saarka;Tusaalaha kale waa bakhtiyaha asaasiga ah, kaas oo saameeya gaar ahaanta.dNTP iyo template waxay ku xidhan yihiin magnesium ion, hoos u dhigista qadarka magnesium ion ee bilaashka ah ee looga baahan yahay dhaqdhaqaaqa enzyme.U fiirsashada ugu fiican ee magnesium ion waxay ku kala duwan tahay lammaane asal ah iyo qaabab kala duwan, laakiin PCR-ga caadiga ah ee bilawga ah ee 200μM dNTP waa 1.5mMHeerarka sare ee ion magnesium-ka bilaashka ah waxay kordhiyaan wax-soo-saarka, laakiin sidoo kale waxay kordhiyaan kordhinta aan gaarka ahayn waxayna hoos u dhigtaa daacadnimada.Si loo go'aamiyo diiradda ugu fiican, titrations magnesium ion ayaa lagu sameeyay kor u kaca 0.5mM laga bilaabo 1mM ilaa 3mM.Si loo yareeyo ku tiirsanaanta hagaajinta ion magnesium, Platinum Taq DNA polymerase waa la isticmaali karaa.Platinum Taq DNA polymerase waxa uu awoodaa in uu ku ilaaliyo shaqada tiro balaadhan oo ah uruurinta ion magnesium ka badan Taq DNA polymerase sidaa awgeedna waxa uu u baahan yahay tayayn yar.
9. Waxyaalaha kor u qaada PCr
Hagaajinta heerkulka soo jiidashada, naqshadaynta asaasiga ah, iyo xoojinta ion magnesium ayaa ku filan kor u qaadida aadka u gaarka ah ee qaababka badankooda;si kastaba ha ahaatee, qaababka qaar, oo ay ku jiraan kuwa leh nuxurka GC sare, waxay u baahan yihiin tallaabooyin dheeraad ah.Waxyaalaha lagu daro ee saameeya heerkulka dhalaalka ee DNA-da ayaa bixiya hab kale oo lagu wanaajiyo gaar ahaan badeecada iyo wax-soo-saarka.Denaturation buuxa ee template ayaa loo baahan yahay natiijada ugu fiican.
Intaa waxaa dheer, qaab-dhismeedka labaad wuxuu ka hortagayaa xiritaanka asaasiga ah iyo kordhinta enzyme.
Waxyaabaha lagu daro PCR, oo ay ku jiraan foramide, DMSO, glycerin, betaine, iyo PCRx Enhancer Solution, waxay xoojiyaan kor u qaadida.Nidaamkooda suurtagalka ah waa in la yareeyo heerkulka dhalaalka, sidaas darteed caawinta nuugista asaasiga ah iyo caawinta kordhinta DNA polymerase iyada oo loo marayo gobolka qaab dhismeedka sare.PCRx Solution waxay leedahay faa'iidooyin kale.Hagaajinta ugu yar ee magnesium ion ayaa loo baahan yahay marka lagu isticmaalo Platinum Taq DNA polymerase iyo Platinum Pfx DNA polymerase.Sidaa daraadeed, farsamada Platinum waxaa lagu daraa wax lagu daro si loo kordhiyo gaar ahaaneed iyada oo la dhimayo ku tiirsanaanta habka saddexaad, hagaajinta ion magnesium.Natiijooyinka ugu fiican, xoojinta waxyaabaha lagu daro waa in la hagaajiyo, gaar ahaan DMSO, formamide, iyo glycerol, kuwaas oo joojiya Taq DNA polymerase.
10. Bilow kulul
Bilawga kulul PCR waa mid ka mid ah hababka ugu muhiimsan ee lagu wanaajin karo PCR-ga gaarka ah marka lagu daro naqshadaynta asaasiga ah ee wanaagsan.In kasta oo heerkulka ugu fiicnaanta ee Taq DNA polymerase uu yahay 72 ℃, polymerase-ku wuxuu weli firfircoon yahay heerkulka qolka.Sidaa darteed, alaabada aan khaaska ahayn ayaa la soo saaraa marka heerkulka haynta uu ka hooseeyo heerkulka annealing inta lagu jiro diyaarinta falcelinta PCR iyo bilowga wareegga kulaylka.Marka la sameeyo, alaabtan aan khaaska ahayn ayaa si wax ku ool ah loo xoojiyay.PCR-bilawga-kuleelka ah ayaa si gaar ah waxtar u leh marka goobaha loo isticmaalo naqshadaynta asaasiga ah ay xaddidan yihiin meesha ay ku jiraan canaasiirta hidde-sidaha, sida beddelka goobta-hagaha, xayndaabka muujinta, ama dhismaha iyo wax-ka-beddelka walxaha hidde-sidaha loo isticmaalo injineernimada DNA.
Habka caadiga ah ee lagu xaddido dhaqdhaqaaqa Taq DNA polymerase waa in la diyaariyo xalka falcelinta PCR ee barafka oo la geliyo qalabka PCR ee horay loo sii kululeeyay.Habkani waa mid fudud oo aan qaali ahayn, laakiin ma dhamaystiro waxqabadka enzymes sidaas darteed si buuxda uma baabi'iyo xoojinta alaabta aan gaarka ahayn.
Kuleylku wuxuu dib u dhigayaa isku-darka DNA-ga isagoo xannibaya qayb muhiim ah ilaa qalabka PCR uu gaaro heerkulka denaturation.Inta badan hababka bilaabista kulaylka gacanta, oo ay ku jirto ku darida daahitaanka Taq DNA polymerase, waa dhib, gaar ahaan codsiyada la soo saaray.Hababka kale ee kuleylka kuleylka ah waxay isticmaalaan gaashaanka dhuka si ay ugu xiraan qayb muhiim ah, oo ay ku jiraan ions magnesium ama ensaymes, ama si jir ahaan loo go'doomiyo qaybaha falcelinta, sida moodooyinka iyo kaydiyeyaasha.Inta lagu jiro wareegga kulaylka, qaybaha kala duwan ayaa la sii daayaa oo la isku daraa marka dhumuhu dhalaalaan.Sida habka bilawga kulul ee buug-gacmeedka, habka gaashaanka wax-soo-saarka waa mid dhib badan oo u nugul wasakhowga oo kuma habboona codsiyada wax-soo-saarka sarreeya.
Platinum DNA polymerase waxay ku habboon tahay oo wax ku ool u tahay PCR bilawga kulul ee tooska ah.Platinum Taq DNA polymerase wuxuu ka kooban yahay dib u habeynta Taq DNA polymerase oo ay weheliso monoclonal antibody ka dhanka ah Taq DNA polymerase.Unugyada difaaca jirka waxaa sameeyay PCR si loo joojiyo dhaqdhaqaaqa enzyme inta lagu jiro haynta heerkulka dheer.Taq DNA polymerase waxaa lagu siidaayay falcelinta intii lagu jiray 94 ℃ dahaarka tillaabada denaturation, dib u soo celinta dhaqdhaqaaqa polymerase buuxa.Si ka duwan kiimikaad wax ka beddelka ah ee Taq DNA polymerase ee bilawga kulaylka, Platinum enzyme uma baahna dahaar dheer oo 94 ℃ (10 ilaa 15 daqiiqo) si loo dhaqaajiyo polymerase.Iyada oo la adeegsanayo PlatinumTaq DNA polymerase, 90% ee waxqabadka Taq DNA polymerase ayaa dib loo soo celiyay 2 daqiiqo ka dib 94 ℃.
Horudhac HS Taq DNA Polymerase
11. Nest-PCR
Wareegyada is-kordhinta ee is-daba-joogga ah ee la isticmaalayo aasaasayaasha buul-ku-jirka ah waxay wanaajin karaan gaarnimada iyo dareenka.Wareegga koowaad waa cod-weyneyn caadi ah oo ah 15 ilaa 20 wareeg.Qayb yar oo ka mid ah badeecada cod-weyneysiinta bilowga ah ayaa la qasi jiray 100 ilaa 1000 jeer waxaana lagu daray wareegga labaad ee cod-weyneysiinta 15 ilaa 20 wareegyo.Haddii kale, alaabta hore ee la xoojiyey waxaa lagu qiyaasi karaa nadiifinta jel.Istaraatiijiyad buul leh ayaa loo isticmaalaa wareegga labaad ee kor-u-qaadista, kaas oo ku xidhi kara isku xigxiga bartilmaameedka gudaha asaasiga hore.Isticmaalka PCR-ga buulka leh waxay yaraynaysaa suurtogalnimada in la kordhiyo goobo bartilmaameedyo badan sababtoo ah waxaa jira dhawr tixood oo bartilmaameed ah oo kaabaya labada nooc ee asaasiga ah.Tirada guud ee wareegyada isku mid ah (30 ilaa 40) ee leh aasaasiyaal isku mid ah ayaa xoojiyay goobaha aan gaarka ahayn.PCR-da la buunbuuniyay waxay kordhisaa dareenka taxanaha bartilmaameedyada xaddidan (tusaale, mrnas naadir ah) waxayna wanaajisaa gaar ahaan PCRS-ta adag (tusaale 5′ RACE).
12. PCR soo degaya
Hoos u dhigida PCR waxay wanaajisaa qaas ahaanshiyaha iyadoo la isticmaalayo xaalado cidhiidhi ah dhowrka wareeg ee ugu horreeya ee PCR.Wareeggu wuxuu ka bilaabmaa heer kul heerkul ah 5℃ oo ka sarreeya qiyaasta Tm, ka dibna wareeg kasta waxaa lagu dhimayaa 1℃ ilaa 2℃ ilaa heerkulka nuglaanta uu ka hooseeyo Tm 5℃.Qaabka loo socdo oo keliya oo leh isu-soocida ugu sarreeya ayaa la kordhin doonaa.Alaabooyinkani waxay sii wadaan inay sii balaariyaan wareegyada xiga, iyagoo ciriiriya alaabada aan gaarka ahayn ee la xoojiyey.Hoos u dhigida PCR waxay faa'iido u leedahay hababka aan la garanayn heerka homology ee u dhexeeya asaasiga aasaasiga ah iyo qaabka bartilmaameedka, sida sawirka faraha DNA ee AFLP.
Xirmooyinka PCR ee la xidhiidha
Halyeyga 2× PCRTMNidaamka isku dhafka ah wuxuu leeyahay dulqaad sare oo ka hortagga PCR marka loo eego nidaamka isku-dhafka PCR ee caadiga ah, wuxuuna si fudud ula qabsan karaa PCR-weyneynta qaabab kala duwan oo adag.Nidaamka falcelinta gaarka ah iyo waxtarka sare ee Taq Hero ayaa ka dhigaya falcelinta PCR inay yeelato hufnaan sare u qaadis, gaar ahaan iyo dareen.
Waxtarka sare-u-qaadista
Waxay leedahay 5'→3' dhaqdhaqaaqa DNA polymerase iyo 5'→3' dhaqdhaqaaqa exonuclease, iyada oo aan lahayn 3'→5' dhaqdhaqaaqa exonuclease.
Waqtiga dhabta ah PCR Easyᵀᴹ-SYBR Cagaarka I Kit
Bakhaar gaar ah oo la hagaajiyay iyo bilowga kulul ee Taq enzyme waxay ka hortagi kartaa kordhinta aan gaarka ahayn iyo samaynta dimer ka
Dareenka sare-wuxuu ogaan karaa nuqullo hoose oo template ah
RT-PCR Easyᵀᴹ I (Hal Tallaabo)
Qalabku waxa uu isticmaalaa reagent transcription u gaar ah Foregene iyo Foregene HotStar Taq DNA Polymerase oo ay weheliso nidaam falcelin gaar ah si si wax ku ool ah loo wanaajiyo waxtarka xoojinta iyo gaar ahaaneed ee falcelinta.
Waqtiga boostada: Meey-09-2023
